Summary
Den nåværende protokollen beskriver et optimalisert 3D nevrale retina induksjonssystem som reduserer vedheft og fusjon av retinale organoider med høy repeterbarhet og effektivitet.
Abstract
Retinopati er en av hovedårsakene til blindhet over hele verden. Undersøkelse av patogenesen er avgjørende for tidlig diagnose og rettidig behandling av retinopati. Dessverre hindrer etiske barrierer innsamling av bevis fra mennesker. Nylig har mange studier vist at humane pluripotente stamceller (PSC) kan differensieres til retinale organoider (RO) ved hjelp av forskjellige induksjonsprotokoller, som har enormt potensial i retinopati for sykdomsmodellering, legemiddelscreening og stamcellebaserte terapier. Denne studien beskriver en optimalisert induksjonsprotokoll for å generere nevral retina (NR) som signifikant reduserer sannsynligheten for vesikulasjon og fusjon, og øker suksessraten for produksjon frem til dag 60. Basert på PSCs evne til å omorganisere seg selv etter dissosiasjon, kombinert med visse komplementære faktorer, kan denne nye metoden spesifikt drive NR-differensiering. Videre er tilnærmingen ukomplisert, kostnadseffektiv, viser bemerkelsesverdig repeterbarhet og effektivitet, presenterer oppmuntrende utsikter for personlige modeller av retinale sykdommer, og leverer et rikelig cellereservoar for applikasjoner som celleterapi, narkotikascreening og genterapitesting.
Introduction
Øyet fungerer som den primære informasjonskilden blant menneskelige sanseorganer, med netthinnen som det viktigste visuelle sensoriske vevet i pattedyrøyne1. Retinopati står som en av de viktigste globale årsakene til øyesykdommer, noe som fører til blindhet2. Omtrent 2,85 millioner mennesker over hele verden lider av varierende grad av synshemming på grunn av retinopati3. Følgelig er undersøkelse av patogenesen avgjørende for tidlig diagnose og rettidig behandling. De fleste studier på human retinopati har primært fokusert på dyremodeller 4,5,6. Imidlertid er den menneskelige netthinnen et komplekst, flerlags vev som består av forskjellige celletyper. Tradisjonelle todimensjonale (2D) cellekulturer og dyremodellsystemer klarer vanligvis ikke å rekapitulere den normale spatiotemporale utviklingen og stoffskiftet til den innfødte menneskelige netthinnen 7,8.
Nylig har 3D-kulturteknikker utviklet seg til å generere vevslignende organer fra pluripotente stamceller (PSC)9,10. Retinale organoider (RO) generert fra humane PSCer i et 3D-suspensjonskultursystem inneholder ikke bare syv retinale celletyper, men viser også en distinkt stratifisert struktur som ligner på den menneskelige netthinnen in vivo 11,12,13. Humane PSC-avledede ROs har vunnet popularitet og utbredt tilgjengelighet og er for tiden de beste in vitro-modellene for å studere utviklingen og sykdommen i den menneskelige netthinnen14,15. I løpet av de siste tiårene har mange forskere vist at humane PSC-er, inkludert embryonale stamceller (ESC) og induserte pluripotente stamceller (iPSCs), kan differensiere til ROs ved hjelp av forskjellige induksjonsprotokoller. Disse fremskrittene har enormt potensial i retinopati for sykdomsmodellering, narkotikascreening og stamcellebaserte terapier 16,17,18.
Imidlertid er generering av nevral retina (NR) fra humane pluripotente stamceller (PSC) en kompleks, tungvint og tidkrevende prosess. Videre kan batch-til-batch-variasjoner i vevsorganoider føre til lavere reproduserbarhet av resultatene19,20. Tallrike inneboende og ekstrinsiske faktorer kan påvirke utbyttet av retinale organoider (RO), for eksempel antall eller arter av startceller og bruk av transkripsjonsfaktorer og småmolekylære forbindelser 21,22,23. Siden den første menneskelige RO ble generert av Sasai laboratorium11, har flere modifikasjoner blitt foreslått gjennom årene for å forbedre enkelheten og effektiviteten av induksjonsprosessen 13,21,24,25. Dessverre er det til dags dato ikke etablert noen gullstandardprotokoll for å generere ROer i alle laboratorier. Faktisk er det en viss grad av avvik i ROs som følge av forskjellige induksjonsmetoder, samt stor variasjon i uttrykket av retinale markører og robustheten av deres struktur22,26. Disse problemene kan i alvorlig grad komplisere prøveinnsamling og tolkning av studiefunn. Derfor er det nødvendig med en mer konsolidert og robust differensieringsprotokoll for å maksimere effektiviteten med minimal heterogenitet av RO-generering.
Denne studien beskriver en optimalisert induksjonsprotokoll basert på en kombinasjon av Kuwahara et al.12 og Döpper et al.27 med detaljerte instruksjoner. Den nye metoden reduserer sannsynligheten for organoid vesikulasjon og fusjon betydelig, og øker suksessraten for å generere NR. Denne utviklingen har stort løfte om sykdomsmodellering, narkotikascreening og celleterapiapplikasjoner for retinale lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen og godkjent av den institusjonelle etiske komiteen ved det kinesiske PLA General Hospital. WA09 (H9) ESC-linjen ble hentet fra WiCell Research Institute.
1. Kulturmedier og reagensforberedelse
- Menneskelig ESC-kulturmedium og passasjeløsning
- Vedlikeholdsmedium (MM): Klargjør 500 ml komplett MM (basalmedium + 5x supplement; se materialfortegnelse) aseptisk. Tine 5x tilskudd ved romtemperatur (RT) eller over natten ved 2-8 °C. Forvarm til RT. Rør godt før bruk til tilskuddet er fritt for uklarhet.
- 1 % ekstracellulær matriks (ECM): Bruk en forkjølt pipetspiss og sterile rør til å dispensere 200 mikrol ECM (se materialfortegnelse) per rør på is. Oppbevar tubene i fryser ved -20 °C. Smelt ECM på is og fortynn med forkjølt DMEM/F12 ved 1:100.
- 0,5 mM pH = 8,0 EDTA: For å forberede 500 ml 0,5 mM EDTA, tilsett 500 μL 0,5 M EDTA og 0,9 g NaCl til 500 ml 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) (se materialtabell). Bland godt og oppbevar ved 2-8 °C.
- Retinal differensiering medium
- Vekstfaktorfritt kjemisk definert medium (gfCDM): Forbered gfCDM ved å kombinere 45% Iscoves modifiserte Dulbeccos medium-GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX), 45% Hams F12-GlutaMAX (F12-Glutamax), 10% knockout serumerstatning (KSR), 1% kolesterollipidkonsentrat og 450 μM tioglycerol (se materialtabell).
- Små molekylære forbindelser
- Y-27632 2HCl: Tilsett 50 mg Y-27632 pulver til 3.122 ml dimetylsulfoksid (DMSO). Y-27632 (se materialfortegnelse) skal dispenseres og oppbevares i en konsentrasjon på 50 mM ved -80 °C i 2 år, og holdes borte fra lys. Fortynn stammaskinen 2,500 ganger (20 μM) for bruk, tilsvarende 0,4 μL Y-27632 per ml gfCDM.
- IWR1-endo: Tilsett 2,4424 ml DMSO for å oppløse 10 mg IWR1-endo (se materialfortegnelse) for å oppnå en 10 mM stamløsning. Dispenser alikoter og oppbevar dem ved -80 °C i opptil 2 år. Tilsett 0,3 μL 10 mM IWR1-endo per ml gfCDM for 3 μM-konsentrasjonen for induksjon.
- SB431542: For å forberede 50 mM SB431542, tilsett 10 mg SB431542 (se materialfortegnelse) til 0,5203 ml DMSO og bland godt. Oppbevares ved -80 °C i oppløsningsvæske i maksimalt 2 år. For fremstilling av SB431542 ved en arbeidskonsentrasjon på 10 μM, tilsett 2 μL av 50 mM stamoppløsning til 10 ml gfCDM.
- LDN-193189 2HCl: Løs opp 5 mg LDN-193189 2HCl (se materialtabell) i 10,4297 ml DMSO for å få en 1 mM stamløsning. Oppbevares ved -20 °C eller -80 °C (som anbefalt av produsenten). Tilsett 0,1 μL av stambeholdningen til hver 10 ml gfCDM, noe som resulterer i 100 nM LDN-193189 for induksjon.
- Rekombinant humant benmorfogenetisk protein 4 (BMP4): Rekonstituer ved 50-200 mikrogram/ml i 4 ml HCl (se materialfortegnelse). Oppbevares ved 2 °C til 8 °C i 1 måned eller -20 °C i 1 år etter rekonstituering. Utfør induksjon av NR ved bruk av 1,5 nM BMP4.
- Langsiktig NR-kulturmedium
- Retinsyre (RA): Mål 6 mg RA-pulver (se materialtabell) og legg til 3,9941 ml DMSO. Oppbevares i alikoter på 5 mM ved -80 °C og brukes innen 3 måneder. For å oppnå en arbeidskonsentrasjon på 0,5 μM, tilsett 10 μL av masterblandingen til 100 ml nevral retina differensieringsmedium (NRDM). Tilsett rett før bruk.
NOTAT: Holdes borte fra lys under klargjøring og lagring. - Taurin: Tilsett taurinpulver (se materialfortegnelse) som veier 200 mg til 7,9904 ml DMSO for å oppnå en 200 ml stamløsning. Utleveres og oppbevares ved 2-8 °C. En arbeidskonsentrasjon på 0,1 mM taurin oppnås ved å tilsette 50 μL av stamløsningen per 100 ml NRDM.
- NRDM: Komponer NRDM med DMEM / F12-GlutaMAX medium, 1% N2 supplement, 10% føtal bovint serum, 0,5 mM RA og 0,1 mM taurin (se materialfortegnelse). Oppbevares ved 2-8 °C i opptil 2 uker eller 6 måneder ved -20 °C for å sikre aktiviteten til komponentene.
- Retinsyre (RA): Mål 6 mg RA-pulver (se materialtabell) og legg til 3,9941 ml DMSO. Oppbevares i alikoter på 5 mM ved -80 °C og brukes innen 3 måneder. For å oppnå en arbeidskonsentrasjon på 0,5 μM, tilsett 10 μL av masterblandingen til 100 ml nevral retina differensieringsmedium (NRDM). Tilsett rett før bruk.
- Blokkeringsbuffer: Fortynn 1:9 med DPBS for å oppnå en 10 % fungerende løsning for bruk (se materialfortegnelse). Oppbevares ved -20 °C i opptil 5 år.
MERK: Utfør alle andre prosedyrer i et biosikkerhetskabinett i klasse II for å sikre sterilitet, bortsett fra veiing. Hvis det er nødvendig å tilsette veide reagenser under fremstillingsprosessen, bruk 0,22 μm filtre for filtrering.
2. Dyrking av H9-ESC
- Tining av H9-ESC
- Tilsett 1 ml 1% ECM til hver brønn i en 6-brønnsplate. Inkuber i 1 time i en inkubator ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
MERK: Unngå å legge til ECM langs brønnveggene, fordi det kan feste seg til overflaten. - Ta en H9-ESC kryovialbestand fra tanken med flytende nitrogen og rist den raskt i 37 °C vann i 30 s.
MERK: Ikke la hetteglasset tine helt. - Fjern hetteglasset og steriliser det forsiktig med 75% desinfiserende alkoholspray. Tilsett tint H9-ESC fra kryovialet til et 15 ml rør inneholdende 9 ml MM med 10 μM Y-27632.
- Sentrifuger røret ved 190 × g i 5 minutter ved RT. Fjern forsiktig det meste av supernatanten med en 1 ml pipette, og etterlater ca. 50 μl supernatant for å unngå celletap.
- Tilsett 1 ml MM inneholdende 10 μM Y27632 til cellesedimentet og resuspender cellesedimentet forsiktig med en 1 ml pipette ved å pipettere opp og ned 5-10 ganger.
- Fjern ECM-belegget etter 1 time inkubasjon. Tilsett 2 ml forvarmet MM inneholdende 10 μM Y-27632 til hver brønn.
- Dispenser 0,5 ml cellesuspensjon per brønn. Rist platen forsiktig sideveis for å sikre jevn fordeling av celler.
- Inkuber platen ved 37 °C under 5 % CO2 i minst 24 timer uten å berøre den.
- Bytt medium daglig. Når klontettheten når 70% og over, er passasje nødvendig.
- Tilsett 1 ml 1% ECM til hver brønn i en 6-brønnsplate. Inkuber i 1 time i en inkubator ved 37 °C i en 5% CO2 atmosfære.
- Passering av H9-ESC
- Klargjør den ECM-belagte platen som beskrevet ovenfor (trinn 2.1.1) og tilsett 2 ml MM per brønn.
- Fjern det brukte mediet fra 6-brønnplatene. Vask hver brønn to ganger med 1 ml DPBS.
- Vask hver brønn to ganger ved sakte å tilsette 1 ml EDTA, og inkubere med 1 ml EDTA i 4-7 min ved RT.
MERK: Under inkubasjonen, undersøk 6-brønnplaten i 3 minutter under et mikroskop. Fortsett umiddelbart til neste trinn hvis de fleste celler er nær å løsne fra parabolen. Unngå lang tid inkubasjon for å redusere negativ innvirkning på cellene. - Kast EDTA og tilsett 1 ml MM for å avbryte fordøyelsen.
- Bank forsiktig på brønnplaten til flertallet av cellene er løsnet.
- Overfør cellesuspensjonen forsiktig til et 15 ml sentrifugerør med en 5 ml pipette. Heng H9-ESC-koloniene forsiktig opp og ned 3-5 ganger for å blande dem med en Pasteur-pitette. Overfør 20-100 μl cellesuspensjon i en ny ECM-belagt 6-brønns kulturskål og rist den frem og tilbake.
- Når celletettheten observeres som tilstrekkelig under et mikroskop, inkuber platen ved 37 ° C under 5% CO2 i minst 24 timer uten å berøre den.
- Bytt media daglig. Ved 70% klontetthet og over er passasje nødvendig.
3. Generering av menneskelige NR
MERK: Når koloniene oppnår omtrent 70% samløp, kan de rettes mot differensiering i retinale organoider (RO) ved hjelp av prosedyretrinnene som er skissert i figur 1.
- Dag 0 - Dannelse av embryoid legeme (EB)
- Etter vasking av cellene med 2 ml DPBS, tilsett 0,5 ml CDS (se materialfortegnelse) inneholdende 20 μM Y27632 til brønnen. Inkuber i 3 minutter ved 37 °C i en fuktet 5 % CO2 -inkubator.
MERK: Sjekk under et mikroskop. Reduser inkubasjonstiden så mye som mulig for å unngå skadelige effekter på cellene. - Avbryt fordøyelsen ved å tilsette 3 ml MM inneholdende 20 μM Y27632. Sentrifuge ved 190 × g i 5 min og kast supernatant.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml gfCDM inneholdende 20 μM Y27632, og tell cellene. Legg til tilsvarende volum for 1,2 × 106 celler (1,2 × 104 celler per brønn) til 10 ml gfCDM, som er forhåndsinnlemmet med 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 og 100 nM LDN-193189 (se materialfortegnelse).
- Tilsett 100 μL cellesuspensjon til hver brønn med 96 V-bunnede koniske brønner. Plasser platen i en fuktet 5% CO2 -inkubator til dag 6.
MERK: Ikke flytt oppvasken i minst 24 timer for å forbedre klebende EB.
- Etter vasking av cellene med 2 ml DPBS, tilsett 0,5 ml CDS (se materialfortegnelse) inneholdende 20 μM Y27632 til brønnen. Inkuber i 3 minutter ved 37 °C i en fuktet 5 % CO2 -inkubator.
- Dag 6 - Retina induksjon
- På dag 6, tilsett 10 ml gfCDM inneholdende 55 ng / ml BMP4 for å tillate en fullstendig endring av kulturmedium på EBs. Sett platen tilbake til inkubatoren.
MERK: Pipett mot veggene i den 96 V-bunnede koniske brønnen for å unngå luftbobler. Unngå å ta opp noen organoider når du bytter medium. - Utfør halv middels endring på dag 9, dag 12 og dag 15. Bytt ut halvparten av mediet med fersk gfCDM for gradvis å fortynne BMP4.
- På dag 6, tilsett 10 ml gfCDM inneholdende 55 ng / ml BMP4 for å tillate en fullstendig endring av kulturmedium på EBs. Sett platen tilbake til inkubatoren.
- Dag 18 - Langsiktig NR-kultur
- På dag 18, overfør de dannede EB-ene forsiktig til 15 ml sentrifugerør med 5 ml Pasteur-pipetter og skyll forsiktig igjen med NRDM. Overfør EBs til 6-brønns eller 24-brønnsplater med lav adsorpsjon (se materialfortegnelse). Sett platen tilbake til inkubatoren.
- Bytt ut mediet med fersk NRDM hver 3.
MERK: Slå av lyset under middels endring fordi RA er lysfølsom. Fjern dårlig differensierte organoider, og separer adherente organoider under et mikroskop.
4. Analyse av humane NR
- Montering av ROene
- Velg forskjellige generasjoner av H9-ESC-er for å indusere tre partier med RO-er.
MERK: Tre plater av antall dannende NR for hver av de tre vurderte metodene (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27, og den modifiserte metoden i denne studien) er beregnet for å vurdere induksjonssuksessraten. Induksjon anses som vellykket hvis lysmikroskopi avslører dannelsen av nevroepitellignende strukturer på dag 30.
- Velg forskjellige generasjoner av H9-ESC-er for å indusere tre partier med RO-er.
- Immunfluorescerende farging av ROs
- Overfør 3-5 ROs til 1,5 ml rør. Pipetter av overflødig medium og vask RO-ene én gang med 1 ml DPBS ved RT. La RO-ene synke og fjern DPBS forsiktig. Tilsett 1 ml 4 % paraformaldehyd (se materialfortegnelse) per 1,5 ml rør og fikser ved 4 °C.
MERK: ROs på dag 6 og dag 18, fiks 2 timer. Fiks i 12 timer på dag 30 og 14 timer på dag 60. - Etter fiksering, dehydrer ved bruk av gradientalkohol. La RO-ene stå i 15 minutter hver i 50%, 60% og 70% alkohol, og deretter i 10 minutter hver i 80%, 90%, 95%, 100% og 100% alkohol. Deretter tilsettes en 1:1-blanding av 100 % alkohol og xylen i 10 minutter, etterfulgt av xylen to ganger i 10 minutter hver.
- Plasser RO-ene i metallformer fylt med smeltet paraplast (se materialfortegnelse) i 40 minutter, og slukk deretter formene på is for å fikse RO-ene. Legg boksene i formene og frys dem ved -20 °C over natten. Deretter løsner du embeddingsboksene forsiktig. Til slutt, lagre dem på RT.
- Lag kontinuerlige seksjoner (5 μm tykkelse) med en parafinkutter. Fest skiver på adhesjonsmikroskoplysbilder, tørk og lagre på RT.
- Utfør devoksing og rehydrering før antigenreparasjon 12,27.
- Tilsett 10 ml 20x pH 6,0 citratantigengjenfinningsløsning (se materialfortegnelse) til 190 ml ddH2O (dobbeltdestillert H2O). Varm i mikrobølgeovn i høy modus i 4 min til det koker. Etter å ha tilsatt parafinseksjoner, varm seksjonene i lav modus i 20 minutter for å fullføre antigenreparasjon.
- La parafinseksjoner avkjøles naturlig i et ventilert område og sett dem deretter inn i et fuktig kammer.
- Bruk en pap penn (se Materialfortegnelse) for å disponere delene. Inkuber med 0,2% Triton X-100 ved RT i 30 min for å bryte membranene, etterfulgt av å vaske lysbildene tre ganger med TPBS, i 5 minutter hver.
- Blokk med 10% eseserum fortynnet i DPBS ved RT i 1 time i et fuktig kammer med 10 μL per fargeområde.
- Tilsett primære antistoffer fortynnet i 10% eselserum. Inkuber over natten ved 4 °C i et fuktighetskammer. Vask prøver tre ganger med TPBS i 10 minutter hver for å fjerne det ubundne antistoffet.
MERK: Primære antistoffer er som følger: anti-PAX6 (1: 250), anti-SOX2 (1: 200), anti-KI67 (1: 200), anti-CHX10 (1: 200), anti-β tubulin III (1: 250) og anti-NESTIN (1: 200) (se materialtabell). - Inkuber med sekundære antistoffer fortynnet i DPBS i 1 time ved RT i et fuktet kammer. Gjenta vasketrinnet med TPBS tre ganger i 10 minutter hver.
MERK: Oppbevares i mørket for å forhindre slukking av det fluorescerende sekundære antistoffet. Sekundære antistoffer er Alexa Fluor 488 konjugert med esel-anti-mus IgG og Alexa Fluor 568 konjugert med esel-antikanin IgG ved en fortynning på 1:400 (se materialfortegnelse). - Inkuber med DPBS som inneholder DAPI (1: 500; se materialfortegnelse) i 10 minutter ved RT i mørket. Vask tre ganger med TPBS i 10 min hver.
- Slipp en passende mengde fluorescerende forsegler (se materialfortegnelse) på lysbildet og dekk til med deksel.
- Visualiser ved hjelp av en flytlignende vevscellekvantitativ analysator (se materialfortegnelse), eller lignende.
- Oppbevar lysbilder ved -20 °C i mørket etter mikroskopisk analyse.
- Overfør 3-5 ROs til 1,5 ml rør. Pipetter av overflødig medium og vask RO-ene én gang med 1 ml DPBS ved RT. La RO-ene synke og fjern DPBS forsiktig. Tilsett 1 ml 4 % paraformaldehyd (se materialfortegnelse) per 1,5 ml rør og fikser ved 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En grafisk oversikt over den modifiserte protokollen er vist i figur 1. H9-ESC ble brukt til å generere ROs når cellene ble dyrket til en tetthet på 70% -80%. Encellede suspensjoner av H9-ESC i 96 V-bunnede koniske brønner aggregert på dag 1 og dannet godt omskrevne runde EB-er innen dag 6. Etter hvert som kulturtiden økte, økte volumet av EB-er gradvis. Dag 30 ble nevroepitellignende strukturer tydelig dannet og fortykket ved langvarig NR-differensiering.
I tillegg ble den modifiserte metoden sammenlignet med to andre metoder (Kuwahara et al.12 og Döpper et al.27) for å evaluere dens repeterbarhet og effektivitet (tilleggsfigur 1). Denne studien observerte også at morfologien til EB på dag 1 etter den modifiserte metoden var litt dårligere enn i de to andre metodene. De nevroepiteliale strukturene som ble dannet med modifisert metode, var imidlertid mer kontinuerlige dag 18 (figur 2). På dag 30 var de tidlige NRene oppnådd ved hjelp av den modifiserte metoden like i form og størrelse og viste en vanlig rund form (figur 3). Sammenlignet med de to andre metodene hadde NR dannet ved den modifiserte metoden en lavere forekomst av vesikulasjon og adhesjon. Videre, basert på H9-ESC-ene, økte suksessraten for å generere NR ved bruk av den modifiserte metoden til 87,39% fra henholdsvis 26,9% og 69,24% for Kuwahara et al. og Döpper et al. sine metoder12,27 (figur 3M).
Immunfluorescensfarging ble utført på parafin-innebygde seksjoner av NR for å evaluere ekspresjon av markører relatert til retinal utvikling (figur 4). Resultatene viste uttrykket av humane gener assosiert med netthinnen i NR avledet fra H9-ESC ved hjelp av en modifisert metode. Den første cellesubtypen som vises er retinal ganglioncellen, som hovedsakelig akkumuleres på basalsiden av NR. TUJ1-farging ble brukt til å identifisere aksonene i retinale ganglionceller (figur 4I-L). Videre ble markører av retinale stamceller detektert i både indre (PAX6+) og ytre (CHX10+) lag (figur 4A-H). Celler som var positive for proliferasjonsmarkøren KI67 ble fordelt i det ytre laget (figur 4A-D).
Figur 1: Skjematisk oversikt. Den skjematiske oversikten over den modifiserte kulturprotokollen viser tillegg av forskjellige faktorer på bestemte tidspunkter og de representative bildene av nevral retinautvikling. SFEBq: serumfri flytende kultur av embryoide kroppslignende aggregater med rask reaggregering; KSR: knockout serum erstatning; gfCDM: vekstfaktorfritt kjemisk definert medium; NRDM: nevral retina differensieringsmedium; BMP4: bein morfogenetisk protein 4.Scale barer: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: De representative lysfeltbildene av retinale organoider avledet fra tre forskjellige protokoller i tidlig stadium. På dag 1 var det bare den modifiserte metoden som ikke var fra EB-ene (A,E,I). På dag 6 dannet EBs i alle tre metodene (B, F, J). Dag 18 ble det dannet tidlige nevrale retinaer, og man fant ulik morfologi blant de tre induksjonsmetodene (C,G,K). Dag 21 viste nevral retina generert ved modifisert metode kontinuerlig nevroepitelstruktur (D,H,L). Skala barer: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Moden 3D nevrale netthinnen i suspensjonskultur ved dagene 30, 45, 60. På dag 30 dannet nevral retina i alle tre metodene (A,E,I). Piler indikerer cystiske strukturer i Kuwahara et al.s metode (B). Hvite prikkede bokser representerer regionen av organoider, vedheft og fusjon til hverandre (D, F, H). Retinale organoider generert fra den modifiserte protokollen er like i størrelse og morfologi sammenlignet med de to andre metodene (C, G, J, K, L). Skala barer: 100 μm (hvit); 200 μm (svart). Statistisk diagram over induksjonssuksessrate ved de tre metodene ved bruk av H9-ESC (M). Enveisanalyse av varians ble brukt for å teste signifikansen (feilfelt viser standardfeil, n = 864, **P < 0,01, ***P < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Karakterisering av nevral retina i den modifiserte protokollen. Immunfargingsbilder av nevral netthinne på dag 6, dag 18, dag 30 og dag 60. Grønne flekker er for KI67 (prolifererende celle), PAX6 (retinal stamcelle) og NESTIN (nevrale stamceller). Røde flekker er for CHX10 (retinal stamcelle), SOX2 (nevrale stamcelle) og TUJ1 (retinal ganglioncelle). Vektstenger: 100 μm (A,B,E,F,I,J); 200 μm (C,D,G,H,K,L). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Sammenligning av flytskjema for de tre retinale organoidinduksjonsprotokollene. SFEBq: serumfri flytende kultur av embryoide kroppslignende aggregater med rask reaggregering; KSR: knockout serum erstatning; gfCDM: vekstfaktorfritt kjemisk definert medium; NRDM: nevral retina differensieringsmedium; BMP4: bein morfogenetisk protein 4. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Morfologien til embryoid legeme (EB) indusert av Kuwaharaet al.s metode. Den gradvise forekomsten av klumper i døde celler ble observert rundt EBs etter tillegg av BMP4 på dag 6 (A-D, svarte piler). Store morfologiske forskjeller ble observert etter dag 6 (E-L), og noen EB var til og med fullstendig inaktivert (H,L). ESC: embryonal stamcelle, PBMC: mononukleær celle i perifert blod, IPSC: indusert pluripotent stamcelle. Skala barer: 200 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Humane ROs kan romlig og temporalt rekapitulere utviklingen av fosterets netthinne, og tidlige ROs viser en høy grad av likhet med fosterets retina i ekvivalente utviklingsstadier15. Når det gjelder vevsmorfologi og molekylært uttrykk, speiler human RO nøye den faktiske vekststatusen til retinalvevet, og gir enorme og enestående muligheter innen sykdomsmodellering, legemiddelscreening og regenerativ medisin. For tiden er det etablert flere forskjellige metoder for å generere ROer fra humane PSC-er in vitro, og kontinuerlige modifikasjoner og optimaliseringer pågår for å forbedre effektivitetenytterligere 9. Sasai-laboratoriet rapporterte for første gang genereringen av PSC-avledede ROer fra humane ESCer11. Humane ESC-er ble først fremstilt i encellede suspensjoner, og deretter ble like mange celler sådd i 96 V-bunnede koniske brønner, med rask aggregering for å danne sirkulærelignende EB-er. Den eksterne tilsetningen av nøkkelcellesignalveier fremmet dannelsen av optiske vesikler i EB, som deretter modnet til laminerte ROer i suspensjonskultur. NR inneholder en gliacelletype og seks forskjellige nevrale celletyper, som representerer mange aspekter av retinal utvikling, for eksempel cellemorfogenese, nevrondifferensiering og apikal-basal polaritet9. Selv om bare 10% av aggregatene dannet en dobbeltvegget optisk koppstruktur, var dette en viktig milepæl i utviklingen av å produsere mer avanserte ROs11.
Deretter introduserte Zhong et al. et nytt alternativ, der hiPSCer først ble dyrket nær sammenløp, etterfulgt av kjemisk eller mekanisk oppløsning i flytende små aggregater13. Deretter dannet de små aggregatene EB i suspensjonskultur, som løsnet separat fra bunnen av platen, og differensierte ytterligere i nevral retning. Zhong et al. demonstrerte en fullstendig laminert 3D retina med relativt velutviklede fotoreceptor ytre segmenter som reagerte på lysstimulering. Denne metoden krevde mindre ekstern regulering av cellesignalveier og ble primært utført på en selvstyrt måte9. Den tredje teknologiske revolusjonen var introduksjonen av embedding-metoden av Lowe group25. Dette innebar å legge inn hESC-aggregater i ECM for å danne en epitelstruktur med ett lumen. Etter enzymatisk dispersjon ble aggregatene opprettholdt i en suspensjonskultur for å danne modne ROer. Selv om alle tre metodene med hell kan indusere ROer med sammenlignbar struktur og funksjon, har store applikasjoner ulempene ved å være tidkrevende og arbeidskrevende på grunn av deres høye heterogenitet og lave suksessrate23.
I tillegg til metodene ovenfor foreslo Kuwahara et al. en ny induksjonsmetode, nemlig nøkkelfaktorgradientnedgangsmetoden12. De fant at NR kunne genereres ved tilsetning av BMP4 ved avtagende konsentrasjon fra dag 6. Dette induksjonssystemet brukte færre eksterne faktorer for å danne ROs med økt ensartethet i størrelse og morfologi. Studier har imidlertid rapportert at de dannede EBene var utsatt for cystiske lesjoner, og suksessraten for induksjon av denne metoden var ca. 40%12,28. Döpper et al. modifiserte denne protokollen for å forbedre suksessraten ved å kombinere et kommersielt medium med tre småmolekylære hemmere på tidlig stadium av induksjon for å stabilisere EBs27. I motsetning til dette holder celler i det nevrale epitelet i netthinnen seg lettere til hverandre, noe som nødvendiggjør separat kultur av hver RO under langvarig suspensjonskultur. Döpper og medarbeideres metode øker komplikasjonene og kostnadene ved eksperimentelle operasjoner og er ikke egnet for storskala induksjon27. Den optimaliserte RO-produksjonsprotokollen forbedret induksjonseffektiviteten. Den nåværende modifiserte metoden ble sammenlignet med metodene til Kuwahara et al. og Döpper et al.
Denne studien viste at både Kuwahara et al. og Döpper et al. sine metoder dannet EBs med glatte kanter på dag 1, mens den nåværende modifiserte metoden krevde relativt lang tid for å danne EB, omtrent til dag 6. Volumet av EBs oppnådd ved hjelp av Kuwahara et al. 's metode var større enn det som ble oppnådd ved hjelp av Döpper et al. 's metode, og EBs oppnådd ved hjelp av Döpper et al. 's metode viste økt fluiditet under væskestrøm. Spesielt dukket det gradvis opp døde celleklumper rundt EBs etter tillegg av BMP4 på dag 6 ved bruk av Kuwahara et al. sin metode (tilleggsfigur 2). Ved dag 18 ble det observert signifikante morfologiske forskjeller i EB for Kuwahara og medarbeideres metode, og noen EBs var fullstendig inaktiverte (tilleggsfigur 2). I Döpper et al. sin metode var flertallet av EBs avrundede og godt omskrevet, og viste bare et lite antall spredte døde celler rundt dem. Den modifiserte metoden dannet tette og velstrukturerte EB med små morfologiske forskjeller, og noen få døde celler ble observert rundt dem.
Videre fant denne studien også at noen EB-er genererte vesikler av Kuwahara et al. i tidlig stadium etter overføring til 6-brønnsplater, noe som resulterte i manglende dannelse av ROer. Adhesjon og fusjon av ROs skjedde rundt dag 40, noe som signifikant reduserte nytten av forsøkene. Dyrkningssystemet til Döpper et al. sin metode er mer komplisert, og krever flere operasjonelle trinn og høyere kostnader enn Kuwahara et al. sin metode. Flertallet av ROs av Döpper et al. utviklet også uunngåelig adhesjoner og fusjoner med hverandre. Den modifiserte metoden i denne studien genererte vellykket 3D NR in vitro som uttrykte de humane retina-relaterte markørene CHX10, KI67, PAX6, SOX2, TUJ1 og NESTIN. Og de fleste ROs ved den modifiserte metoden var konsistente i størrelse og morfologi, og svært få vesikler eller adhesjoner utviklet seg i de sene stadiene av retinal differensiering.
Sammenlignet med de to andre metodene hadde det nye kultursystemet enklere driftstrinn og lavere kostnader. Det kritiske trinnet i den modifiserte metoden er å legge til tre småmolekylære hemmere i media og sikre at platen ikke flyttes de første seks dagene for å stabilisere strukturen til EB. Bevegelsen av plater eller cellemanipulasjon i tidlig stadium kan påvirke dannelsen av EB. Sammenlignet med de to andre metodene endret ikke den modifiserte metoden mediet på dag 1 og reduserte også bruken av småmolekylære hemmere på dag 15. Kort sagt, operasjonstrinnene i den modifiserte metoden forenkles til en viss grad, og den eksperimentelle kostnaden spares med mindre bruk av medier og reagenser. Den modifiserte metoden kan imidlertid fortsatt ikke løse de vanlige problemene med dagens organoidkultursystem. I tillegg avhenger ROs induksjonseffektivitet i stor grad av kvaliteten og differensieringsevnen til hPSCs. I denne studien ble bare effektiviteten av NR-generering ved bruk av H9-ESC fullstendig beregnet. Vi induserte vellykket ROs i forskjellige hPSC-linjer med den nye metoden i denne studien, og oppnådde samme induksjonseffektivitet, inkludert H9, H1 og PBMC-iPSC. Det er ingen statistisk forskjell i induksjonseffektivitet mellom de tre cellelinjene. I fremtiden må flere studier undersøke induksjonseffektiviteten til forskjellige hPSCer ved hjelp av denne metoden.
Avslutningsvis er den optimaliserte retinale induksjonsprotokollen enkel og billig, har høy repeterbarhet og effektivitet, tilbyr lovende personlige modeller av retinale sykdommer, og gir en rikelig cellekilde for celleterapi, legemiddelscreening og genterapitesting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
- Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
- Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
- Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
- Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
- Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
