Dissekering av ögonhjärnkomplexet från fly pupae: En metod för att isolera näthinnevävnad

Overview

Denna video beskriver hur man dissekerar och isolerar ögon-hjärnkomplexet från Drosophila pupae. Det presenterade protokollet visar förfarandet som ger högkvalitativ vävnad, kompatibel med till exempel immunostaining, liksom andra genuttrycksexperiment.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från DeAngelis och Johnson, Dissekering av Drosophila Pupal Retina för Immunohistochemistry, Western Analysis och RNA Isolation,   J. Vis. Exp. (2019).

1. Vävnadsberedning

1. Ställ in Drosophila kors (som beskrivits tidigare i Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) eller kulturspecifika Drosophila stammar för att få puppar av önskad genotyp. För att säkerställa att ett stort antal puppar dyker upp av en tillfällighet, etablera dessa flugkulturer i duplikat på näringsrika matmedier eller vanliga livsmedelsmedier generöst kompletterade med jästpasta.
2. Behåll Drosophila kulturer vid 25 °C. För kors som använder UAS-GAL4-systemet är GMR-GAL4 en idealisk drivrutin uttryckt i larv ögon skivceller posterior till den morfogenetiska fåran och under hela pupal utveckling. Korset UAS-lacZ X GMR-GAL4 fungerar som ett idealiskt kontrollkors eftersom det driver uttryck för det icke-endogena och inerta β-galactosidasproteinet.
3. Använd spetsen på en 6-tums bambuskena som har blötts med destillerat vatten för att försiktigt lyfta vita pre-puppar(figur 1B)från sidan av friska odlingsflaskar(figur 1A)och placera i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör ( Figur1C).
4. Placera rören i en spetsbox av plastpipetter tillsammans med en liten bit vävnad som blötläggs i destillerat vatten för att hålla kammaren vid tillräcklig fuktighet för att skydda popparna från uttorkning (Figur 1D). Inkubera popparna vid 25 °C tills de dissekeringen.
5. Använd en torr 6" bambuskena för att försiktigt trycka ut popparna från mikrocentrifugröret och på en svart dissekeringsform. Lägg en ny bit dubbelsidig tejp på dissekeringsfatet bort från popparna.
6. Använd ett par tångar och placera försiktigt puppens dorsala sida uppåt (dvs. operculums vända uppåt, figur 1B)på tejpen (figur 2A). Se till att popparna håller sig väl på tejpen.
   OBS: Fukt på popp fallet kommer att hämma säker vidhäftning till tejpen, i vilket fall, låt popparna lufttorka innan de placeras på den dubbelsidiga tejpen.

2. Dissekering av ögonhjärnkomplex

1. Använd tång för att avlägsna operculumet på varje popp(bild 2C).
2. Använd mikrodissektionssax för att skära eller skära upp pupalväskan på varje popp. Lock öppna pupal fodralet för att avslöja huvudet, bröstkorgen och främre buken segmentet, säkra kanterna på pupal fodralet till dubbelsidig tejp (Figur 2C).
   OBS: Det är inte nödvändigt att helt avslöja popparna.
3. Genomborra buken på varje popp med skarpa tångar, för att ta tag i djuret och ta bort det från sitt poppfall (Figur 2C).
4. Placera popparna på den svarta dissekeringsformen, bort från tejpen, och täck med ca 400 μL iskyl fosfatbuffrad lösning (PBS, pH 7.4).
5. Ta tag i varje popp vid buken med tång och med mikrodissektionssax, gör ett rent tvärsnittssnitt genom hela bröstkorgen och skär poppan i hälften (Figur 2D).
6. Ta bort den bakre kvarlevan av varje slaktkropp från PBS och lägg åt sidan på dissekeringsskålen (kassera inte, se steg 3.2.1).
7. Med hjälp av två par fina tångar öppnar du bröstkorgen och huvudet på varje popp för att avslöja ögonhjärnkomplexet (Figur 2E). För att göra detta, ta tag i bröstkorgsepitelets skärkanter och riv gradvis för att öppna bröstkorgen och sedan huvudkapseln och exponera ögonhjärnkomplexet och omgivande fettvävnad.
8. Utan att greppa vävnaden, använd tång för att styra ögonhjärnkomplexet bort från resterna av huvudkapseln eller skopa ögonhjärnkomplexet från den sönderslitna huvudkapseln.
   OBS: Ögonhjärnkomplexet är hantelformat, offvitt och mer genomskinligt än det omgivande krämfärgade fettet (Figur 2B,E).
9. Med tång, ta försiktigt bort det mesta fettet i samband med ögonhjärnkomplexen utan att röra ögonvävnaden.

3. Bearbetning av vävnad för immunofluorescens

1. Dissekera minst 6-10 puppar enligt beskrivningen (steg 2.1-2.9).
   OBS: Tre till fyra oberoende replikat av varje dissekering tenderar att ge tillräckligt med data för att testa en hypotes.
2. Tvätt och fixering
   1. Skär spetsen på en P20- eller P100-pipettspets med ett rent rakblad för att öka spetsöppningen till ~ 1 mm i radie och smörj genom att pipettera en blandning av PBS och fett upp och ner. Detta fett kan erhållas från slaktkroppsresterna som avlägsnas i steg 2.6.
   2. Överför ögonhjärnkomplexen till ~ 400 μL PBS i en 9-brunns glasrätt, på is. Använd den smorda spetsen och en P20- eller P100 luftförskjutningsmikropipett för överföring.
      OBS: Ögonhjärnkomplex kommer att hålla fast vid omonterade spetsar under pipettering och skadas eller förloras.
   3. Ta bort det återstående fettet i samband med ögonvävnaden genom att pipetting PBS upp och ner för att försiktigt virvla ögon-hjärnkomplexen. I detta och alla efterföljande tvättsteg, rör inte direkt ögonhjärnkomplex upp och ner eftersom detta kommer att skada den bräckliga ögonvävnaden.
   4. Överför ögonhjärnkomplexen i en minimal volym (<20 μL) pbs till minst 250 μL fixativ. Blanda genom att pipetting lösningen upp och ner. Inkubera i 35 min, på is.
      OBS: Samma smorda spets som bereds i steg 3.1.1 kan användas för denna överföring.
   5. Med samma pipettspets överför du ögonhjärnkomplexen till en brunn som innehåller ~ 400 μL PBS. Blanda genom att pipetting lösningen upp och ner och inkubera i 5-10 min på is, för att tvätta. Upprepa tvättsteget minst två gånger.
      OBS: Ögonhjärnkomplex kan underhållas i flera timmar i den slutliga PBS-tvätten, på is eller vid 4 °C, innan de fortsätter till steg 3.3.1.
3. Antikroppsfärgning
   1. För att blockera vävnaden före exponering för antikroppslösningar, överför ögonhjärnkomplexen till ~ 400 μL PBT. Använd den smorda spetsen och en P20- eller P100 luftförskjutningsmikropipett för överföringen. Inkubera i 10 till 60 minuter, på is.
   2. Förbered den primära antikroppslösningen genom att späda ut lämpliga antikroppar i PBT. Eftersom ögon-hjärnkomplex inkuberas i 10 μL alikvoter av antikroppslösning, kommer volymen som framställs att vara en replikat av 10.
   3. Alikvot 10 μL antikroppslösning i en ren brunn på en 72-brunns mikrobrunnsbricka.
   4. Kapa spetsen på en P10-pipettspets med ett rent rakblad för att öka spetsöppningen till ~ 0,5 mm i radie och smörj genom att pipettera PBT upp och ner.
   5. Överför högst 5 ögonhjärnkomplex i en volym av <3 μL PBS till varje 10 μL antikroppslösning med hjälp av en P10 luftförskjutningsmikropipett och den smorda spetsen.
   6. Homogenisera antikroppslösningen genom att leda lösningen upp och ner. Pipetten inte ögonhjärnan komplex upp och ner eftersom detta kommer att skada vävnaden.
   7. För att minimera avdunstning av antikroppslösningen, placera en liten bit vävnad som blötläggs i destillerat vatten i mikrobrunnsbrickan och försegla brickan (t.ex. med locket). Inkubera över natten vid 4 °C.
   8. Överför ögonhjärnkomplexen från mikrobrunnsbrickan till ~ 400 μL PBT i en 9-brunnig glasform, för att tvätta. Använd en P10 luftförskjutningsmikropipett och PBT-smörjd spets (bered enligt beskrivningen i steg 3.3.4). Blanda genom att pipetting lösningen upp och ner. Inkubera i 5-10 min på is.
   9. Upprepa tvättsteget minst två gånger. Använd en P20- eller P100 luftförskjutningsmikropipett och PBT-smörjd spets för att överföra ögonhjärnkomplexen mellan tvättlösningar.
   10. Förbered den sekundära antikroppslösningen genom att späda ut lämpliga fluorformärkta sekundära antikroppar i PBT efter behov. 100 μL sekundär antikroppslösning är tillräcklig per sats på 6-10 puppar. Aliquot den sekundära antikroppslösningen i en 9-brunnig glasdessektionsform.
   11. Överför ögonhjärnkomplexen till sekundär antikroppslösning. Använd en P20- eller P100 luftförskjutningsmikropipett och PBT-smörjd spets för överföringen.
   12. Inkubera ögonhjärnkomplexen i sekundär antikroppslösning i 1-2 timmar vid rumstemperatur eller 3-5 timmar vid 4 °C. För att förhindra blekning av fluorforer genom ljus, täck preparatet med folie.
       OBS: Optimal inkubationstid i sekundär antikroppslösning kan variera beroende på de primära och sekundära antikroppar som används.
   13. Överför ögonhjärnkomplexen till ~ 400 μL PBT i en 9-brunns glasfat, för att tvätta. Blanda genom att pipetting lösningen upp och ner. Inkubera i 5-10 min på is. Detta tvättsteg bör upprepas minst två gånger.
4. Sekundär fixering
   1. För en sekundär fixering, överför ögonhjärnkomplexen till minst 200 μL fixativ och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur eller 35 min vid 4 °C.
      OBS: Sekundär fixering stelnar ögonvävnaden, vilket underlättar montering (steg 3.5).
   2. Använd en P20- eller P100 luftförskjutningsmikropipett och PBT-smörjd spets för att överföra ögonhjärnkomplex till ~ 400 μL PBT i en 9-brunns glasform, på is, för att tvätta i 5 min.
   3. Upprepa tvättsteget minst en gång.
   4. Använd en P20- eller P100 luftförskjutningsmikropipett och PBT-smörjd spets för att överföra ögonhjärnkomplexen till ~ 400 μL PBS i en 9-brunns glasform, på is, för att skölja i 1-2 minuter. Håll vävnaden i rörelse genom att pipetting PBS, men inte vävnaden, upp och ner för att förhindra ögon-hjärnkomplex från att bosätta sig och hålla fast vid glasfatet under PBS-sköljning.
5. Montering
   1. Överför ögonhjärnkomplexen till ~200 μL monteringsmedier. Använd en P20- eller P100 luftförskjutningsmikropipett och PBT-smörjd spets för att överföra ögonhjärnkomplexen. Låt vävnaden balansera i monteringsmedier i 1-2 timmar.
   2. Placera en 5-8 μL droppe nytt monteringsmedier på en ren mikroskopbild.
   3. Kapa en P10-spets med ett rent rakblad för att öka spetsöppningen till ~ 0,5 mm i radie och använd denna och en P10 luftförskjutningsmikropipett för att överföra ögonhjärnkomplexen i 5-8 μL monteringsmedia till droppen av monteringsmedier på glid.
   4. Använd två volframnålar för att separera ögonen från optiska lober. Fäst ett ögonhjärnkomplex i rutschkanan med en robust volframnål och skär varje öga bort från tillhörande optisk lob med en fin volframnål (Figur 2F).
   5. Använd den fina volframnålen för att manövrera varje öga till mikroskopets yta glida med den basala ytan på varje öga intill bilden. Sänk försiktigt en ren täckspnad över vävnaden och säkra med nagellack.
      OBS: Att ordna ögonen på bilden så att de är nära varandra eller i en linje kommer att underlätta efterföljande mikroskopi.
   6. Avbilda näthinnan med fluorescerande eller konfokal mikroskopi.
      OBS: Diabilderna ska förvaras vid 4 °C om de inte avbildas omedelbart.

Representative Results

Figur 1: Urval och pupakultur för dissekering. (A) Vandrande tredje larv instar (L3) larver och puppar lokalisera längs sidorna av friska Drosophila kulturer. (B) Pre-puppar kan identifieras med sin genomskinliga vita färg eftersom pigment ännu inte har genererats i det skyddande pupalfodralet. Främre-bakre och dorsala-ventrala axeln i poppan visas i blått. En fuktig bambuskena används för att lossa och plocka pre-pupae från injektionsflaskan väggar. C)Puppar placeras inuti 1,5 ml mikrocentrifugrör som är märkta på lämpligt sätt (genotyp, uppsamlingsdatum och uppsamlingstid)och (D)odlas inuti en fuktad kammare monterad från en tom pipettspetslåda. Luftfuktigheten upprätthålls genom att placera en bit fuktig vävnad inuti lådan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Dissekera pupalögat. A)Pupae fästs vid dubbelhäftande tejp på en svart dissekeringsfat. Främre, bakre och dorsala koordinater anges i blått. (B) För att isolera ögon-hjärnkomplex (en enda visas här), (C) tas poppan först bort från sitt poppfall. Viktiga steg i den här processen visas. Röda linjer anger var man ska riva och öppna pupalfallet efter att operculum har avlägsnats. Popparna avlägsnas sedan från det sönderslitna poppväskan med tång. (D) En exponerad poppa skärs först längs bröstkorgen med mikrodissektionssax (läge indikerat med streckad röd linje) och huvudepitelet rivs sedan försiktigt upp (röda pilar), som visas i (E) för att avslöja det ogenomskinliga ögonhjärnkomplexet. F)Efter inkubation med lämpliga antikroppar skärs näthinnor från ögonhjärnkomplex. Viktiga steg i den här processen visas. Ögonhjärnan stabiliseras med en robust volframnål (vänster) och näthinnan avlägsnas med en fin volframnål (höger). För protein- och RNA-analyser kan ofixerade näthinnor skäras rent från optiska lober med hjälp av ett fint rakblad eller mikrodissektionssax, snarare än en fin volframnål. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bamboo splints, 6"	Ted Pella Inc	116
Black dissecting dish			Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder	Fine Science Tools	10053
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Double-sided tape	3M	665
Drosophila& food media, nutrient-rich			7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila& food media, standard			Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Fixative solution			4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Glass 9-well dishes	Corning	7220-85	Also known as 9-well dishes
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	12-550-413
Glass petri dish	Corning	3160-100BO
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microcentrigure tubes	Axygen	MCT-175-C
Microdissection scissors	Fine Science Tools	15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells)	Nunc	438733
Mounting media			0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate	Sigma-Aldrich	P3130
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Sigma-Aldrich	P5368	Prepare according to manufacturer's instructions
PBT			0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1	Cell signaling	9578S	For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCAD2	For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
Scalpel blades	Fine Science Tools	10050	Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Cell Signaling Technology	7077	For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	For Western blotting. Used at 1:3000
Stereo dissecting microscope (M60 or M80)	Leica Microsystems		or similar microscope
Sylgard (black)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsten needle, fine	Fine Science Tools	10130-10	Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy	Fine Science Tools	10130-20	Insert into pin holder
Yeast paste	(local supermarket)		Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O