Summary
Questo protocollo fornisce informazioni tecniche per la ricostruzione dei vasi utilizzando la tecnica della cuffia nel trapianto di fegato ortotopico di topo.
Abstract
Il trapianto ortotopico di fegato di topo è una metodologia efficace per studiare i meccanismi alla base dell'ischemia epatica e del danno da riperfusione. Tuttavia, le sfide tecniche rappresentano un ostacolo all'utilizzo di questo prezioso modello sperimentale e alla trasmissione di queste competenze alla generazione successiva. L'aspetto più impegnativo di questa procedura è la ricostruzione vascolare, compresa la vena porta (PV), la vena cava inferiore infraepatica (IHIVC) e la vena cava inferiore sopraepatica. L'uso di bracciali in plastica, piuttosto che di suture, consente una ricostruzione PV e IHIVC più agevole. I vasi vengono ricostruiti attaccando una cuffia costituita da un catetere endovenoso alla punta del vaso dell'innesto e interponendo la cuffia nel vaso ricevente. I due aspetti più cruciali sono la corretta visualizzazione del lume interno del vaso ed evitare l'uso di una forza eccessiva. Il nostro obiettivo è fornire una panoramica tecnica delle ricostruzioni vascolari utilizzando la tecnica della cuffia nella chirurgia del ricevente. Questi suggerimenti tecnici per la tecnica del bracciale dovrebbero aiutare i microchirurghi a facilitare la ricostruzione vascolare e far progredire la loro ricerca.
Introduction
Il trapianto di fegato ortotopico di topo (MOLT) è un metodo sperimentale efficace riportato per la prima volta nel 19911. Questo modello sperimentale, che utilizza topi geneticamente modificati e vari reagenti di ricerca, ha svolto un ruolo fondamentale nello studio delle lesioni da ischemia calda e fredda e da riperfusione. Tuttavia, l'elevata complessità tecnica del modello ha ostacolato lo sviluppo della medicina di base per il trapianto di fegato2. La MOLT prevede tre fasi principali: (1) recupero del fegato dal topo donatore, (2) intervento chirurgico sul retro e (3) impianto del fegato nel ricevente. Tra queste procedure riceventi, l'anastomosi vascolare rappresenta la sfida più grande. Mentre l'anastomosi della vena cava inferiore sopraepatica è tipicamente completata dalla cucitura a mano2, la vena cava inferiore infraepatica (IHIVC) e la vena porta (PV) possono essere ricostruite in modo più efficiente utilizzando polsini di plastica al posto di suture cucite a mano.
Il periodo anepatico indica l'intervallo tra la rimozione del fegato nativo del ricevente e l'impianto dell'innesto. Per garantire risultati coerenti, è imperativo limitare il tempo anepatico a meno di 20 minuti. Di conseguenza, gli studi che utilizzano questo modello sono stati limitati a istituzioni specifiche 3,4,5,6,7,8,9. Tra le varie fasi della MOLT, ottenere una ricostruzione fluida di PV e IHIVC è fondamentale per ridurre al minimo il tempo anepatico e garantire il successo del trapianto.
La ricostruzione PV e IVC viene generalmente eseguita utilizzando bracciali vascolari poiché la tecnica del bracciale semplifica l'anastomosi vascolare rispetto alle suture cucite a mano 2,5,8. La tecnica coinvolta nella preparazione della cuffia vascolare e nell'attacco sicuro della cuffia ha un impatto significativo sulla complessità della ricostruzione vascolare ricevente. Il nostro obiettivo è fornire una guida visiva dettagliata per numerosi suggerimenti tecnici relativi al metodo del bracciale, riducendo così la curva di apprendimento. Questi video clip forniranno una chiara comprensione di come attaccare la cuffia ai vasi e ricostruire il PV e l'IHIVC durante l'intervento chirurgico del ricevente.
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Protocol
Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato per la sperimentazione animale dell'Università di Kyoto. Lo studio ha utilizzato topi C57BL/6, di età superiore a 10 settimane e di peso compreso tra 25 g e 30 g, ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Tutti gli animali sono stati anestetizzati con isoflurano al 2,5% (seguendo protocolli approvati istituzionalmente), mantenuti in specifiche condizioni prive di agenti patogeni e tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con i regolamenti sulla sperimentazione animale dell'Università di Kyoto. Gli strumenti appropriati utilizzati per lo studio sono elencati nella Tabella dei materiali e illustrati nella Figura 1 e nella Figura 2.
1. Selezione degli animali
- Usa topi con un peso corporeo di 25-30 g.
NOTA: Mentre gli allotrapianti di fegato di topo2 sono generalmente accettati attraverso la barriera del complesso maggiore di istocompatibilità, in questo studio abbiamo optato per il modello MOLT singenico per concentrarci sul meccanismo dettagliato del danno da riperfusione da ischemia fredda10. I topi di peso inferiore a 25 g non sono raccomandati perché è impossibile inserire uno stent interno in un dotto biliare sottile. Allo stesso modo, i topi di peso superiore a 30 g non sono raccomandati a causa della presenza di una grande quantità di grasso intraaddominale intorno ai vasi.
2. Fabbricazione del bracciale
- Preparare cateteri endovenosi da 20 G e 16 G rispettivamente per PV e IHIVC.
- Usando un bisturi, tagliare il catetere per creare la cuffia. Il corpo principale del bracciale deve misurare 2 mm di lunghezza, con una maniglia di estensione di 1 mm (Figura 3A).
NOTA: Se la maniglia è troppo grande, potrebbe diventare difficile inserire il bracciale. - Sulla superficie del bracciale, creare una scanalatura poco profonda per il fissaggio del filo utilizzando il dorso della lama del bisturi.
NOTA: Quando si applica la parte posteriore della lama del bisturi al bracciale, assicurarsi che la punta della lama sia ad un angolo di circa 60 gradi (come mostrato nella Figura 3B). Dopo aver praticato la prima scanalatura, fissare la lama del bisturi e ruotare il bracciale. Idealmente, si consigliano due scanalature, ma una singola scanalatura può essere sufficiente senza problemi.
3. Attacco del bracciale
- In un contenitore di plastica di forma rettangolare, posizionare dei piccoli cubetti di ghiaccio e posizionare sopra una piccola tazza di metallo (6 cm di diametro). Riempire la coppetta con liquido per la conservazione degli organi (vedere Tabella dei materiali) e posizionare l'innesto singenico all'interno.
- Arrotolare delicatamente l'innesto epatico singenico (estratto da un altro topo donatore) utilizzando un batuffolo di cotone, assicurandosi che la porta epatide sia rivolta verso l'alto. Rimuovere accuratamente il sangue immagazzinato nel lume dell'IVC con liquido per la conservazione degli organi.
- Infilare il PV attraverso il bracciale utilizzando un filo attaccato, ad esempio, alla vena splenica (vedere Figura 4A).
- Con l'impugnatura del bracciale a ore 12, fissare sia l'impugnatura che il bracciale con un bulldog clamp (vedi Tabella dei materiali), posizionandolo a 2-3 mm dal bordo PV.
- Fissare ulteriormente il morsetto bulldog utilizzando una grande pinza vascolare e uno stampo di fissaggio per stabilire il campo operatorio (vedere la Figura 4B).
- Ispezionare attentamente il lume fotovoltaico con un ingrandimento di circa 15-20x. Se necessario, l'acqua gocciolante può migliorare la visibilità del lume.
- Afferra delicatamente il lume fotovoltaico ed esternalo attraverso il bracciale.
- Una volta completamente esternalizzato, fissarlo con una doppia legatura usando 8-0 filo di seta lungo la scanalatura del bracciale (Figura 4C,D).
NOTA: Assicurarsi che la legatura non sia allentata. Inoltre, fare attenzione che il punto di legatura non sia troppo grande, poiché potrebbe interferire con l'inserimento della cuffia. Il punto di legatura può essere posizionato in qualsiasi direzione. - Fissare il bracciale all'IHIVC utilizzando una procedura simile a quella utilizzata per il PV (Figura 4E).
NOTA: Quando si blocca l'IHIVC con il bracciale, evitare di mordere il parenchima epatico. Poiché il collo è più corto del PV, determinare attentamente la posizione di bloccaggio. - Creare un nodo scorsoio facendo passare il filo attorno alla base dell'IHIVC per legare temporaneamente l'IHIVC (Figura 5). Questo filo verrà rimosso dopo la riperfusione.
4. Ricostruzione della vena porta
- Anestetizzare il topo ricevente inducendo l'anestesia con isoflurano al 2,5% e ridurlo allo 0,6% prima di estrarre il fegato nativo come descritto nella letteratura pubblicata2. Dinsinfettare l'area chirurgica almeno tre volte con cicli alternati di iodoforo ed etanolo al 70% prima della laparotomia.
- Assicurarsi che il lobo epatico sia posizionato correttamente e che il PV cuffiato sia privo di attorcigliamenti e torsioni.
- Afferrare delicatamente il bordo fotovoltaico del ricevente usando una pinza Pean e fissarlo con una morsa.
NOTA: In questo articolo, una morsa si riferisce a un apparato meccanico utilizzato per fissare la pinza Pean sul tavolo. Per ulteriori informazioni sulla morsa, vedere Tabella dei materiali. - Applicare un morsetto vascolare al PV del ricevente e passare un 8-0 filo di seta attorno ad esso.
- Creare una sezione circonferenziale di 1/4 a circa 0,5 mm dal bordo FV (Figura 6A). Ingrandire il foro facendo passare la soluzione salina attraverso il lume utilizzando uno strumento specializzato (un ago da 27 G con la punta tagliata e piegata a forma di L).
- Utilizzare una pinza dritta per afferrare l'impugnatura del bracciale e inserirla nel lume.
- Una volta completamente inserito, fissare il bracciale con un 8-0 filo di seta. Una singola legatura è sufficiente per la fissazione.
- Rimuovere il morsetto vascolare e riperfondere il fegato.
- Rilasciare con cautela la pinza di Pean e completare la ricostruzione della vena porta. L'intero processo di ricostruzione fotovoltaica dovrebbe richiedere circa 5 minuti.
5. Ricostruzione infraepatica della vena cava inferiore
- Posizionare il lobo del fegato in modo appropriato e spostare la pinza Pean attaccata alla dorsale IHIVC ricevente al lobo inferiore destro dell'innesto, fissandola con una morsa.
- Eliminare il tessuto epatico rimanente intorno all'IVIHC del ricevente strofinando delicatamente con un batuffolo di cotone.
- Passa un 8-0 filo di seta attorno all'IVIHC del destinatario.
- Creare una sezione circonferenziale di 1/4 a circa 0,5 mm dal bordo IVIHC del ricevente (Figura 6B).
- Dopo aver introdotto la normale soluzione salina nel lume, inserire il bracciale nel lume.
NOTA: A causa del collo corto, il bracciale viene spesso inserito in modo più superficiale rispetto al PV. - Fissare con cura il bracciale con un 8-0 filo di seta e quindi rimuovere il morsetto vascolare e la pinza Pean.
6. Assistenza postoperatoria
- Utilizzare un termoforo e una lampada riscaldante per facilitare il recupero postoperatorio.
- Monitora continuamente la pressione sanguigna, la frequenza cardiaca, la frequenza respiratoria, la temperatura corporea, nonché il consumo di cibo e acqua.
- Somministrazione di iniezione sottocutanea di carprofene (5 mg/kg, ogni 6 ore o fino al bisogno) per alleviare il dolore postoperatorio. Segui le linee guida istituzionali locali.
NOTA: Se le condizioni dei topi peggiorano, l'esperimento verrà interrotto immediatamente e i topi sono stati soppressi per inalazione di anidride carbonica. - Per raccogliere il campione di tessuto, anestetizzare nuovamente i topi e sopprimerli con un metodo approvato dall'IACUC.
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Representative Results
La ricostruzione PV ha successo quando, dopo aver sbloccato la vena porta, non c'è tortuosità e il fegato è uniformemente perfuso. Il tempo anepatico deve essere inferiore a 20 minuti, poiché i tempi anepatici superiori a 25 minuti aumentano il rischio di mortalità dei topi. La ricostruzione IHIVC è considerata efficace se non vi è rigurgito di sangue dall'innesto.
La conservazione dell'innesto a basse temperature per 1 ora utilizzando una soluzione di conservazione dell'organo determina un livello sierico di alanina aminotransferasi di circa 2.000 U/L a 6 ore dopo la riperfusione (Figura 7A). Il tasso di sopravvivenza è del 100% a 7 giorni dal trapianto (Figura 7B). Tuttavia, nel nostro modello senza anastomosi dell'arteria epatica, i topi riceventi possono soccombere a problemi correlati al biloma intraepatico circa 30 giorni dopo il trapianto
Figura 1: Strumenti per la ricostruzione vascolare. Le pinze diritte o curve vengono utilizzate secondo necessità per la situazione e il campo operatorio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il microscopio. Il microscopio è dotato di una lente dell'obiettivo con ingrandimento 10x e di una lente oculare con ingrandimento di almeno 0,8x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Preparazione del bracciale. (A) Il bracciale per il PV e l'IHIVC. (B) Una rappresentazione schematica del processo di creazione di una scanalatura sul bracciale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Attacco del bracciale. (A) Il filo attaccato al PV viene fatto passare nel bracciale. (B) Configurazione dello strumento per il fissaggio del bracciale. (C) Fissaggio del bracciale con 8-0 Legature in seta. (D) Illustrazione schematica dell'esternalizzazione vascolare e della fissazione al bracciale. (E) Attacco del bracciale completato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Legatura temporanea della radice IHIVC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Ricostruzione vascolare. Questa illustrazione mostra le posizioni per la creazione di fori per (A) PV e (B) IHIVC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Risultati postoperatori. (A) Livelli sierici di alanina aminotransferasi (ALT) a 6 ore dopo la riperfusione. CIT, tempo ischemico freddo; Tx, trapianto. p < 0,0001. (B) Sopravvivenza del ricevente dopo MOLT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'apprendimento della ricostruzione vascolare è l'aspetto più impegnativo per ottenere una MUT di successo. La qualità del bracciale influenza in modo significativo la difficoltà della ricostruzione, date le piccole dimensioni dei topi5. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione, il fissaggio e la ricostruzione della cuffia.
Sebbene non ci siano grandi differenze rispetto ai rapporti precedenti per quanto riguarda la preparazione e la connessione del bracciale 2,5, è necessario considerare alcuni punti minori. Innanzitutto, lo spessore del manico del bracciale dovrebbe essere limitato a circa 1/6 della circonferenza totale. Se è troppo sottile, il manico può piegarsi facilmente e diventare difficile da afferrare. Se è troppo spesso, potrebbe essere difficile da maneggiare nell'addome del ricevente. Identificare le tue preferenze personali in anticipo è essenziale.
In secondo luogo, la visibilità del lume sul tavolo posteriore è fondamentale. Viene utilizzato un filo di nylon 10-0, attaccato alla vena splenica del donatore come punto di riferimento per confermare il lume fotovoltaico. Il filo di nylon è posizionato a ore 8 per evitare torsioni eccessive. La parete del vaso viene esternata afferrandola a ore 3 e 9 con due pinze e premendola contro la parete del bracciale a ore 6. Fissaggio con 8-0 Il filo di seta richiede movimenti attenti. Un fissaggio adeguato si ottiene fissandolo nella scanalatura. Dopo il fissaggio, sollevare il bracciale per verificare che non si stacchi.
In terzo luogo, durante la ricostruzione, è importante non creare un foro troppo grande nel vaso ricevente perché il foro si allarga naturalmente quando viene inserito il bracciale. Fare un grande foro può portare alla spaccatura del vaso, la causa più comune di guasto. In particolare nella ricostruzione IHIVC, dovrebbero essere praticati fori più piccoli poiché la lunghezza inferiore di IHIVC lo rende più facile da estrarre rispetto a un fotovoltaico. Quando si fa passare la soluzione salina attraverso il lume, sostenere l'inserimento della cuffia applicando una forza verso l'alto anziché verso il basso.
Le cause comuni di guasto e le precauzioni sono state discusse in dettaglio. I punti più cruciali includono la garanzia di una chiara visualizzazione del lume del vaso interno ed evitare forze non necessarie durante l'inserimento della cuffia per evitare la divisione del vaso. Si ritiene che questi suggerimenti tecnici per il metodo del bracciale elevino le competenze e facciano progredire la ricerca.
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Disclosures
Nessun autore ha conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla ricerca di base JST 2022 (The Japanese Society for Transplantation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Shen, X. D., et al. Inflammatory responses in a new mouse model of prolonged hepatic cold ischemia followed by arterialized orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 11 (10), 1273-1281 (2005).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Tian, Y., Rüdiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Kojima, H., et al. T cell carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1-T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 3 cross talk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248 (2023).
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
