Summary
פרוטוקול זה מספק מידע טכני לשחזור כלי דם באמצעות טכניקת השרוול בהשתלת כבד אורתוטופית בעכבר.
Abstract
השתלת כבד אורתוטופית בעכבר היא מתודולוגיה יעילה לחקר המנגנונים הבסיסיים של איסכמיה בכבד ופגיעה ברפרפוזיה. עם זאת, האתגרים הטכניים מציבים מחסום לשימוש במודל ניסיוני יקר ערך זה ולהעברת מיומנויות אלה לדור הבא. ההיבט המאתגר ביותר של הליך זה הוא שחזור כלי דם, כולל וריד הפורטל (PV), וריד נבוב נחות אינפרא-הפטי (IHIVC), ווריד נבוב נחות על-הכבד. השימוש באזיקים מפלסטיק, במקום בתפרים, מאפשר שחזור PV ו-IHIVC חלק יותר. כלי הדם משוחזרים על ידי הצמדת שרוול העשוי מצנתר תוך ורידי לקצה כלי ההשתלה והחדרת השרוול לכלי המקבל. שני ההיבטים המכריעים ביותר הם לדמיין כראוי את לומן הפנימי של הכלי והימנעות משימוש בכוח מוגזם. מטרתנו היא לספק סקירה טכנית של שחזורי כלי דם באמצעות טכניקת השרוול בניתוח מושתל. טיפים טכניים אלה לטכניקת השרוול צפויים לסייע למיקרוכירורגים להקל על שחזור כלי הדם ולקדם את מחקרם.
Introduction
השתלת כבד אורתוטופית בעכבר (MOLT) היא שיטה ניסיונית יעילה שדווחה לראשונה בשנת 19911. מודל ניסיוני זה, המשתמש בעכברים מהונדסים גנטית וריאגנטים מחקריים שונים, מילא תפקיד מרכזי בחקירת איסכמיה חמה וקרה ופציעות רפרפוזיה. עם זאת, המורכבות הטכנית הגבוהה של המודל עיכבה את פיתוח הרפואה הבסיסית להשתלת כבד2. MOLT כולל שלושה שלבים עיקריים: (1) שליפת הכבד מהעכבר התורם, (2) ניתוח שולחן אחורי, ו-(3) השתלת הכבד במקבל. מבין ההליכים המושתלים הללו, אנסטומוזה וסקולרית מהווה את האתגר הגדול ביותר. בעוד שהאנסטומוזה של הווריד הנבוב התחתון העל-כבד מסתיימת בדרך כלל על ידי תפירה ידנית2, ניתן לשחזר את הווריד הנבוב התחתון האינפרא-הפטי (IHIVC) ואת הווריד הפורטלי (PV) בצורה יעילה יותר באמצעות אזיקי פלסטיק במקום תפרים שנתפרו ביד.
תקופת הכבד מסמלת את המרווח בין הסרת הכבד המקומי של המקבל לבין השתלת השתל. כדי להבטיח תוצאות עקביות, זה הכרחי להגביל את הזמן anhepatic לפחות מ 20 דקות. כתוצאה מכך, מחקרים המשתמשים במודל זה הוגבלו למוסדות ספציפיים 3,4,5,6,7,8,9. בין השלבים השונים של MOLT, השגת שחזור PV ו- IHIVC חלק הוא חיוני למזעור זמן ההדבק ולהבטחת השתלה מוצלחת.
שחזור PV ו- IVC מתבצע בדרך כלל באמצעות אזיקי כלי דם מכיוון שטכניקת השרוול מפשטת אנסטומוזה וסקולרית בהשוואה לתפרים תפורים ביד 2,5,8. הטכניקה הכרוכה בהכנת שרוול כלי הדם וחיבור בטוח של השרוול משפיעה באופן משמעותי על מורכבות שחזור כלי הדם של הנמען. מטרתנו היא לספק הדרכה ויזואלית מפורטת לטיפים טכניים רבים הקשורים לשיטת השרוול, ובכך להפחית את עקומת הלמידה. קטעי וידאו אלה יספקו הבנה ברורה כיצד לחבר את השרוול לכלי הדם ולשחזר את PV ו- IHIVC במהלך ניתוח מושתל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הוועדה לניסויים בבעלי חיים באוניברסיטת קיוטו. במחקר נעשה שימוש בעכברי C57BL/6, בני יותר מ-10 שבועות ובמשקל שבין 25 גרם ל-30 גרם, שהתקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). כל בעלי החיים הורדמו עם 2.5% איזופלורן (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות), נשמרו בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים, וכל הליכי הניסוי נערכו בהתאם לתקנות הניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת קיוטו. המכשירים המתאימים ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים ומתוארים באיור 1 ובאיור 2.
1. בחירת בעלי חיים
- השתמש עכברים עם משקל גוף של 25-30 גרם.
הערה: בעוד שאלושתלי כבד עכבר2 מקובלים בדרך כלל על פני מחסום מורכב של היסטותאימות מרכזית, בחרנו במודל MOLT הסינגני במחקר זה כדי להתמקד במנגנון המפורט של פגיעה בזילוח איסכמיה קרה10. עכברים במשקל של פחות מ -25 גרם אינם מומלצים מכיוון שאי אפשר להחדיר סטנט פנימי לצינור מרה דק. באופן דומה, עכברים במשקל של יותר מ -30 גרם אינם מומלצים בשל נוכחות של כמות גדולה של שומן תוך בטני סביב כלי הדם.
2. הכנת שרוול
- הכינו צנתרים תוך ורידיים של 20 G ו-16 G עבור PV ו-IHIVC, בהתאמה.
- בעזרת אזמל, חותכים את הצנתר ליצירת השרוול. אורך הגוף העיקרי של השרוול צריך להיות 2 מ"מ, עם ידית מאריכה של 1 מ"מ (איור 3A).
הערה: אם הידית גדולה מדי, ייתכן שיהיה מאתגר להכניס את השרוול. - על פני השרוול, צור חריץ רדוד לקיבוע חוטים באמצעות גב להב האזמל.
הערה: בעת הנחת גב להב האזמל על השרוול, ודא שקצה הלהב נמצא בזווית של כ-60 מעלות (כפי שמוצג באיור 3B). לאחר ביצוע החריץ הראשון, אבטחו את להב האזמל וסובבו את השרוול. באופן אידיאלי, מומלץ שני חריצים, אך חריץ אחד יכול להספיק ללא בעיות.
3. חיבור שרוול
- במיכל פלסטיק בצורת מלבני, מניחים קוביות קרח קטנות ומניחים מתכת קטנה (בקוטר 6 ס"מ) מעל. מלאו את הכוס בנוזל לשימור איברים (ראו טבלת חומרים) והניחו בתוכה את השתל הסינגני.
- גלגלו בעדינות את שתל הכבד הסינגני (המופק מעכבר תורם אחר) באמצעות צמר גפן, וודאו שהפורטה הפטיס פונה כלפי מעלה. הסר ביסודיות כל דם המאוחסן לומן של IVC עם נוזל שימור איברים.
- השחילו את ה-PV דרך השרוול באמצעות חוט המחובר, למשל, לווריד הטבור (ראו איור 4A).
- כאשר ידית השרוול במצב השעה 12, הדקו את הידית ואת השרוול באמצעות מהדק בולדוג (ראו טבלת חומרים), ומקמו אותו במרחק של 2 עד 3 מ"מ מקצה ה-PV.
- הדקו את מהדק הבולדוג עוד יותר באמצעות מלקחיים וסקולריים גדולים ותבנית קיבוע כדי לבסס את שדה הניתוח (ראו איור 4B).
- בדקו היטב את לומן ה-PV בהגדלה של פי 15 עד פי 20 בקירוב. במידת הצורך, טפטוף מים יכול לשפר את הראות של לומן.
- אחזו בעדינות בלומן ה-PV והחצינו אותו דרך השרוול.
- לאחר החצנה מלאה, אבטחו אותו עם קשירה כפולה באמצעות 8-0 חוט משי לאורך חריץ השרוול (איור 4C,D).
הערה: ודא שהליגטורה אינה רופפת. כמו כן, יש לוודא שנקודת הרצועה אינה גדולה מדי, שכן היא עלולה להפריע להחדרת השרוול. ניתן למקם את נקודת החיבור לכל כיוון. - חברו את השרוול ל-IHIVC באמצעות הליך דומה לזה המשמש ל-PV (איור 4E).
הערה: בעת הידוק IHIVC עם השרוול, הימנע מלנגוס בפרנכימת הכבד. מכיוון שהצוואר קצר יותר מה- PV, קבע בזהירות את מיקום ההידוק. - צור פתק על-ידי העברת החוט סביב בסיס IHIVC כדי לקשור באופן זמני את IHIVC (איור 5). חוט זה יוסר לאחר רפרפוזיה.
4. שחזור ורידים בפורטל
- להרדים את העכבר המושתל על ידי גרימת הרדמה עם איזופלורן ב -2.5% ולהפחית אותו ל -0.6% לפני חילוץ הכבד המקומי כמתואר בספרות שפורסמה2. Dinsinfect את האזור הכירורגי לפחות שלוש פעמים עם סיבובים לסירוגין של יודופור ו 70% אתנול לפני laparotomy.
- ודא כי האונה הכבדית ממוקמת כראוי וכי PV אזוק הוא ללא פיתול פיתול.
- אחזו בעדינות בקצה ה-PV של הנמען באמצעות מלקחיים מסוג Pean ואבטחו אותו באמצעות ויזה.
הערה: במאמר זה, ויזה מתייחסת למכשיר מכני המשמש לאבטחת מלקחיים אפונים על השולחן. לקבלת מידע נוסף על vise, ראה טבלת חומרים. - החל מהדק כלי דם על PV של הנמען ולהעביר 8-0 חוט משי סביבו.
- צור חתך היקפי של 1/4 במרחק של כ-0.5 מ"מ מקצה ה-PV (איור 6A). הגדילו את החור תוך העברת תמיסת מלח דרך הלומן באמצעות מכשיר מיוחד (מחט 27 גרם עם קצה חתוך וכפוף לצורת L).
- השתמש במלקחיים ישרים כדי לאחוז בידית השרוול ולהכניס אותה לתוך הלומן.
- לאחר החדרתו המלאה, הדקו את השרוול עם 8-0 חוט משי. קשירה אחת מספיקה לקיבוע.
- הסר את מהדק כלי הדם ו reperfuse את הכבד.
- שחררו בזהירות את מלקחיים האפונה והשלימו את שחזור ורידים פורטליים. כל תהליך השחזור של PV אמור להימשך כ-5 דקות.
5. שחזור וריד נבוב נחות אינפרא-הפטי
- מקמו את אונת הכבד כראוי והזיזו את מלקחיים האפונים המחוברים לגבי המושתל לאונה התחתונה הימנית של השתל, תוך אבטחתה באמצעות ויזה.
- סלקו את כל רקמת הכבד שנותרה סביב IVIHC של הנמען על ידי שפשוף עדין עם צמר גפן.
- פס"ד 8-0 חוט משי סביב IVIHC של הנמען.
- צור חתך היקפי של 1/4 במרחק של כ-0.5 מ"מ מקצה IVIHC של הנמען (איור 6B).
- לאחר החדרת תמיסת מלח רגילה ללומן, הכנס את השרוול ללומן.
הערה: בשל הצוואר הקצר, השרוול מוכנס לעתים קרובות בצורה רדודה יותר מאשר PV. - אבטחו בזהירות את השרוול עם 8-0 חוט משי ולאחר מכן להסיר את מהדק כלי הדם ואת מלקחיים אפונה.
6. טיפול לאחר הניתוח
- השתמש בכרית חימום ומנורת חימום כדי להקל על ההתאוששות לאחר הניתוח.
- ניטור רציף של לחץ הדם, קצב הלב, קצב הנשימה, טמפרטורת הגוף, כמו גם צריכת מזון ומים.
- הזרקה תת עורית של קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג, כל 6 שעות או עד הצורך) להקלה על כאבים לאחר הניתוח. פעל בהתאם להנחיות המוסדיות המקומיות.
הערה: אם מצבם של עכברים מתדרדר, הניסוי יופסק מיד ועכברים הומתו על ידי שאיפת פחמן דו חמצני. - כדי לאסוף את דגימת הרקמה, הרדימו מחדש את העכברים והרדימו אותם בשיטה שאושרה על ידי IACUC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שחזור PV מוצלח כאשר, עם פתיחת הידוק הווריד הפורטלי, אין פיתול, והכבד מחורר באופן אחיד. זמן הכבד צריך להיות מתחת ל -20 דקות, מכיוון שזמני הכבד העולים על 25 דקות מגבירים את הסיכון לתמותת עכברים. שחזור IHIVC נחשב מוצלח אם אין פליטת דם מהשתל.
אחסון השתל בטמפרטורות קרות למשך שעה אחת באמצעות תמיסת שימור איברים מביא לרמת אלנין אמינוטרנספראז בסרום של כ-2,000 U/L לאחר 6 שעות לאחר הרפרפוזיה (איור 7A). שיעור ההישרדות הוא 100% לאחר 7 ימים לאחר ההשתלה (איור 7B). עם זאת, במודל שלנו ללא אנסטומוזה של עורק הכבד, עכברים מושתלים עלולים להיכנע לבעיות הקשורות לבילומה תוך כבדית כ -30 יום לאחר ההשתלה
איור 1: מכשירים לשחזור כלי דם. מלקחיים ישרים או מעוקלים משמשים לפי הצורך למצב ולשדה האופרטיבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: המיקרוסקופ. המיקרוסקופ מצויד בעדשה אובייקטיבית בהגדלה של פי 10 ובעדשת עינית עם הגדלה של פי 0.8 לפחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הכנת השרוול. (A) השרוול עבור PV ו-IHIVC. (B) ייצוג סכמטי של תהליך יצירת חריץ על השרוול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: חיבור שרוול. (A) החוט המחובר ל-PV מועבר לתוך השרוול. (ב) התקנת מכשיר לחיבור שרוול. (ג) אבטחת השרוול עם 8-0 קשירת משי. (D) המחשה סכמטית של החצנת כלי הדם וקיבוע השרוול. (ה) חיבור השרוול הושלם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: קשירה זמנית של שורש IHIVC. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שחזור כלי דם. איור זה מציג את המיקומים ליצירת חורים עבור (A) PV ו- (B) IHIVC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תוצאות לאחר הניתוח. (A) רמות של אלנין אמינוטרנספראז בסרום (ALT) לאחר 6 שעות לאחר רפרפוזיה. CIT, זמן איסכמי קר; טקס, השתלה. עמ' < 0.0001. (ב) הישרדותו של המקבל לאחר MOLT. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לימוד שחזור כלי דם הוא ההיבט המאתגר ביותר בהשגת MOLT מוצלח. איכות השרוול משפיעה באופן משמעותי על קושי השחזור, בהתחשב בגודל הקטן של עכברים5. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט להכנת השרוול, חיבורו ושחזורו.
אמנם אין הבדלים משמעותיים מדיווחים קודמים לגבי הכנת השרוול וחיבורו 2,5, אך יש לקחת בחשבון כמה נקודות קטנות. ראשית, יש להגביל את עובי ידית השרוול לכ-1/6 מההיקף הכולל. אם היא דקה מדי, הידית יכולה בקלות להתכופף ולהיות קשה לתפיסה. אם הוא עבה מדי, זה עלול להיות מאתגר לטפל בבטן של הנמען. זיהוי ההעדפה האישית שלך בשלב מוקדם הוא חיוני.
שנית, הנראות של הלומן בשולחן האחורי היא קריטית. חוט ניילון 10-0 משמש, מחובר לווריד הטבור של התורם כציון דרך כדי לאשר את לומן PV. חוט הניילון ממוקם בשעה 8 כדי למנוע פיתול מוגזם. קיר הכלי מוחצן על ידי אחיזתו בשעה 3 ובשעה 9 עם שני מלקחיים והצמדתו לקיר השרוול בשעה 6. קיבעון עם 8-0 חוט משי דורש תנועות זהירות. קיבוע הולם מושג על ידי אבטחת אותו בחריץ. לאחר החיבור, הרימו את השרוול כדי לוודא שהוא לא יורד.
שלישית, במהלך השחזור, חשוב לא ליצור חור גדול מדי בכלי המקבל מכיוון שהחור גדל באופן טבעי עם החדרת השרוול. יצירת חור גדול יכולה להוביל לפיצול כלי הדם, הגורם השכיח ביותר לכישלון. במיוחד בשחזור IHIVC, יש ליצור חורים קטנים יותר מכיוון שהאורך הקצר יותר של IHIVC מקל על שליפתו מאשר PV. כאשר מעבירים תמיסת מלח דרך הלומן, תמכו בהחדרת השרוול על ידי הפעלת כוח כלפי מעלה ולא כלפי מטה.
סיבות נפוצות לכישלון ואמצעי זהירות נדונו בפירוט. הנקודות המכריעות ביותר כוללות הבטחת הדמיה ברורה של לומן כלי הדם הפנימי והימנעות מכוח מיותר במהלך החדרת השרוול כדי למנוע פיצול כלי. מאמינים כי טיפים טכניים אלה לשיטת השרוול משפרים מיומנויות ומקדמים את המחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לאף מחבר אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מחקר בסיסי JST 2022 (האגודה היפנית להשתלות).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF2032 | IHIVC cuff |
| 20 G intravenous catheter | TERUMO | SR-FF1651 | PV cuff |
| 8-0 braid silk | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 silk |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Astellas | Organ preservation fluid | |
| Bulldog clamp | B BRAUN | FB329R | Bulldog clamp |
| C57BL/6 mice | Oriental Bio Service | ||
| Isoflurane inhalation solution | Viatris | Anesthesic | |
| Micro Blunted Tips 0.1 mm x 0.06 mm | F.S.T | 11253-20 | Straight microforceps |
| Micro Serrefine Clamp Applicator with Lock | F.S.T | 18056-14 | Vessel clip applicator |
| Micro Serrefines | F.S.T | 18055-4 | Vessel clip |
| No.11 Spare Blades | FEATHER Safety Razor | 11 | Blades |
| Ophthalmic scissor, round handle | B BRAUN | FD103R | Microscissor |
| Plastic rectangular-shaped container | Daiso | 10 cm long, 15 cm wide and 6 cm high | |
| SuperGrip Tips | F.S.T | 00649-11 | Curved microforceps |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Microscope |
| Vise | Niigataseiki | 00505351 | A mechanical tool to secure Pean forceps on the table |
References
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Shen, X. D., et al. Inflammatory responses in a new mouse model of prolonged hepatic cold ischemia followed by arterialized orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 11 (10), 1273-1281 (2005).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Tian, Y., Rüdiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Kojima, H., et al. T cell carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1-T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 3 cross talk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248 (2023).
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
