카노르하비티스 예르간단일세포 해리 : 살아있는 세포를 분리하는 방법

Overview

이 비디오는 전체 웜을 FACS 또는 그대로 세포의 면역 침전에 적합한 단일 세포 현탁액으로 해리시키는 방법을 설명합니다.

Protocol

이 프로토콜은 독일 외에서발췌, Roundworm Caenorhabditis elegans에서특정 뉴런 인구의 격리, J. Vis. Exp. (2019).

1. 세포 격리를 위한 숙성된 웜의 준비 및 수집

참고: 아래에 설명된 것은 미네소타 대학의 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC) 균주 저장소에서 얻은 형질 전환 unc-17에서콜린성 뉴런의 격리입니다. 곰팡이 나 박테리아의 오염을 방지하기 위해 멸균 조건을 유지하는 것이 필수적입니다.

1. T. 스티에나글에 의해 설명된 대로 표백 방법을 통해 벌레를 준비하고 동기화합니다. 노화 실험을 위해, 판벌레는 알 생산을 줄이고 계란 부화를 체포하기 위해 플루오로옥시리딘 (FuDR)의 25 μM 물 용액을 포함하는 선충 성장 매체 (NGM) 플레이트에. 이 신뢰할 수없는 결과를 일으킬 수 있으므로 오염 또는 계란 부화를 방지하기 위해 정기적으로 한천 접시를 검사합니다.
   참고: unc-17::GFP 셀의 경우, 전형적으로 3개의 100mm x 15mm NGM 플레이트가 충분한 양의 관심 있는 세포를 격리하는 데 사용됩니다.
2. 웜을 수집하고 셀 격리를 위한 버퍼를 준비합니다.
   1. 15mL 원문 튜브에서 웜을 수집합니다. M9 완충제 1.5mL(M9_4,85m NaCl, 42m MM Na₂HPO4,7H₂O, 22mM KH₂PO, pH 7.0) 및 원심분리기 1,600x g로플레이트에서 벌레를 씻어낸다. 1mL의 M9 버퍼로 상체를 버리고 벌레를 씻어주세요. 원심분리를 반복하고 총 5회 세척하여 대장균 오염을 최대한 많이 제거합니다.
      참고: 이 단계에서 암피실린과 같은 항생제(50 μg/mL)를 첨가하면 세균 오염을 줄일 수 있습니다.
   2. 2개의 견본을 위해, 나트륨 도데킬 황산염 디티오트리톨 (SDS-DTT) lysis 버퍼의 2 mL를 준비하십시오: 200 mM MM DTT, 0.25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8.0), 및 3% (w/v) sucrose.
   3. 15mL의 절연 버퍼(118m NaCl, 48m KCl, 2mM CaCl_2,2mM MgCl_2,25 mM HEPES [pH 7.3])를 준비하고 얼음위에 보관한다.
      참고: SDS-DTT 용해 버퍼와 격리 버퍼는 각 실험 전에 새로 만들어야 합니다.
3. 큐티클 중단 및 단일 세포 격리
   1. 원심분리기 동물은 1,600 x g에서 5 분 동안 1.2.1 단계에서 수집되었습니다. 모든 상체를 제거하고 M9 매체의 1mL에서 웜을 일시 중단하고 1.5mL 마이크로 센심분리기 튜브로 이송하십시오.
   2. 원심분리가 있는 펠릿 웜은 5분 동안 1,600 x g에서 원심분리를 합니다.
   3. 웜에 SDS-DTT 용해 버퍼 200 μL을 추가하고 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다. 벌레는 가벼운 현미경으로 볼 경우 몸을 따라 "윙크"된 것처럼 보일 수 있습니다.
      참고: SDS-DTT 용해 버퍼에 장기간 노출되면 웜이 사망할 수 있으며 웜을 관찰하여 모니터링할 수 있습니다. 죽은 벌레는 길게 하고 곱슬말리지 않을 것입니다.
   4. 얼음 차가운 절연 버퍼 800 μL을 넣고 튜브를 부드럽게 가볍게 가볍게 섞습니다.
   5. 펠릿 벌레는 4°C에서 13,000 x g에서 1분 동안, 상체를 제거하고 1mL의 절연 버퍼로 세척합니다.
   6. 총 5회 동안 1.3.5단계를 반복하여 매번 격리 버퍼를 조심스럽게 제거합니다.
   7. 연쇄상 구균 (15 mg/mL)(재료 의 표)에서프로테아제 혼합물 100 μL을 추가하고 펠릿에 격리 버퍼에 용해하고 RT에서 10-15 분 동안 배양하십시오.
      참고: SDS-DTT 용해 완충제와 마찬가지로, 연장된 프로테아제 소화는 플라즈마 멤브레인을 따라 단백질의 과도한 분열을 초래할 수 있으며, 자기 구슬을 통해 노출된 표면의 절연을 방지할 수 있다.
   8. 프로테아제 혼합물을 배양하는 동안 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브의 바닥에 대해 위아래로 피펫팅하여 기계적 중단을 적용하여 ~60-70배의 200μL 마이크로파이펫 팁을 사용한다. 피펫 팁을 미세 원심 분리기 튜브의 벽에 대고 세포를 적절하게 분리하기 위해 일정한 압력으로 유지하십시오.
   9. 소화의 단계를 결정하기 위해 소화 혼합물의 소량 (~1-5 μL)을 제거하고 유리 슬라이드에 떨어 뜨리고 조직 배양 현미경을 사용하여 검사하십시오. 5-7 분 의 잠복 후, 벌레 조각은 눈에 띄게 큐티클을 감소해야하고 세포의 슬러리가 쉽게 볼 수 있습니다.
   10. 10% 태아 소 혈청(FBS)과 페니실린-스트렙토마이신(최종 농도 50 U/mL 페니실린 및 50 μg/mL 연쇄절제술)으로 보충된 900 μL의 반응중단.
   11. 펠릿 분리 된 단편 및 세포는 4 °C에서 10,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리에 의해 분리되었습니다. 펠릿 세포를 1mL의 차가운 L-15 보충 매체로 두 번 더 씻어 과도한 파편과 큐티클이 제거되도록 하십시오.
   12. L-15 보충 된 매체의 1 mL에서 펠렛 세포를 다시 중단하고 30 분 동안 얼음에 둡니다. 상단 층, 약 700-800 μL, 마이크로 원심 분리기 튜브에 가져 가라. 이 층은 세포 이물질이없는 세포를 포함하고 관심있는 세포의 후속 격리에 사용됩니다.
   13. 제조업체의 지시에 따라 자동화된 세포 카운터 또는 혈류계를 사용하여 격리 된 세포의 10-25 μL의 세포 밀도를 측정하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010