Summary
Udforskningen af cellulær adfærd under mekanisk stress er afgørende for fremskridt inden for cellulær mekanik og mekanobiologi. Vi introducerer fMPA-teknikken (Fluorescence Micropipette Aspiration), en ny metode, der kombinerer kontrolleret mekanisk stimulering med omfattende analyse af intracellulær signalering i enkeltceller. Denne teknik undersøger nye dybdegående undersøgelser af levende celle mekanobiologi.
Abstract
Mikropipetteaspirationsanalyser har længe været en hjørnesten i undersøgelsen af levende cellemekanik og giver indsigt i cellulære reaktioner på mekanisk stress. Dette papir beskriver en innovativ tilpasning af fluorescenskoblet mikropipetteaspiration (fMPA) assay. fMPA-analysen introducerer evnen til at administrere præcise mekaniske kræfter, samtidig med at de overvåger de levende cellemekanotransduktionsprocesser, der medieres af ionkanaler. Den sofistikerede opsætning inkorporerer en præcisionsudviklet borosilikatglasmikropipette forbundet til et fint reguleret vandreservoir og pneumatisk aspirationssystem, hvilket letter kontrolleret trykpåføring med trin så raffinerede som ± 1 mmHg. En signifikant forbedring er integrationen af epifluorescensbilleddannelse, hvilket muliggør samtidig observation og kvantificering af cellemorfologiske ændringer og intracellulære calciumfluxer under aspiration. fMPA-analysen sætter gennem sin synergistiske kombination af epifluorescensbilleddannelse med mikropipetteaspiration en ny standard for studiet af cellemekanosensdannelse i mekanisk udfordrende miljøer. Denne mangesidede tilgang kan tilpasses forskellige eksperimentelle opsætninger, hvilket giver kritisk indsigt i enkeltcellemekanosenseringsmekanismerne.
Introduction
De udfoldede opdagelser i verden af cellulær adfærd har fremhævet rollen som mekaniske stimuli, såsom spænding, væskeforskydningsspænding, kompression og substratstivhed, i diktering af dynamiske cellulære aktiviteter såsom vedhæftning, migration og differentiering. Disse mekanobiologiske aspekter er af afgørende betydning for at belyse, hvordan celler interagerer med og reagerer på deres fysiologiske miljøer, hvilket påvirker forskellige biologiske processer 1,2.
I løbet af det sidste årti har mikropipettebaserede aspirationsanalyser skilt sig ud som et alsidigt værktøj til at studere forskellige cellulære reaktioner på mekaniske stimuli. Denne teknik giver værdifuld indsigt i de iboende mekaniske egenskaber af levende celler på enkeltcelleniveau, herunder cellulært elastisk modul, stivhed og kortikal spænding. Disse analyser muliggør måling af forskellige mekaniske parametre, såsom cellemembranspænding, tryk udøvet på cellemembranen og kortikal spænding (opsummeret i tabel 1). At studere aspirationskræfterne har beriget vores forståelse af, hvordan de påvirker cellulære funktioner og processer, især inden for membrandynamik, herunder fragmentering, forlængelse og spirende 3,4.
| Mekanisk parameter | Beskrivelse | Skelsættende tilgange |
| Cellestivhed | Måling af en celles mekaniske stivhed og elasticitet. | Aspiration af cellemembranen og analyse af deformationsrespons på undertrykket20,21. |
| Vedhæftningsstyrke | Evaluering af, hvor stærkt celler klæber til overflader. | Anvendelse af kontrolleret sugning til løsrivelse af klæbende celler fra et substrat2,22. |
| Membranspænding | Vurdering af spændingen eller spændingen i cellemembraner. | Måling af membrandeformation som reaktion på påført tryk23,24. |
| Viskoelastiske egenskaber | Karakterisering af en celles kombinerede viskøse og elastiske adfærd. | Analyse af det tidsafhængige deformationsrespons på aspiration23,25. |
| Deformerbarhed | Bestemmelse af, hvor let en celle kan ændre form. | Vurdering af omfanget af deformation under kontrolleret sugning20,24. |
| Overfladespænding | Måling af spændingen ved cellens overflade. | Vurdering af det tryk, der kræves for at danne et fremspring af mikropipettemembranen26. |
| Celle-materiale interaktion | Undersøgelse af interaktioner mellem celler og materialer eller substrater. | Aspiration af celler i kontakt med forskellige materialer og observation af interaktioner2,24. |
| Celle-celle interaktion | Undersøgelse af interaktioner mellem naboceller. | Aspiration af en gruppe celler og analyse af deres intercellulære kræfter27. |
Tabel 1: Mekaniske parametre karakteriseret ved mikropipetteaspirationsassayet.
Den mikropipettebaserede aspirationsteknik er blevet brugt i vid udstrækning til at studere røde blodlegemer (RBC'er), vurdere deformerbarheden og forskellige mekaniske egenskaber ved RBC'er, hvilket er afgørende for at forstå deres funktion i kredsløbssystemet. RBC'er udviser bemærkelsesværdig tilpasningsevne og bevarer deres mekaniske alsidighed mod deformation, når de navigerer gennem det indviklede kapillærnetværk og interendotelkløfter 5,6. Under denne rejse skal RBC'er krydse gennem passager så smalle som 0,5-1,0 μm og udsætte sig for en lang række mekaniske kræfter, herunder spænding og kompression 7,8,9. De har også høj følsomhed over for forskydningsspændingen, der genereres af blodgennemstrømningen under cirkulation10. Disse processer fremmer aktiveringen af reguleringsmekanismer, der involverer calciumtilstrømning, en afgørende signalhændelse med veletablerede roller i cellulære reaktioner på mekaniske stimuli11,12. De komplekse mekanismer, der styrer calciummedieret mekanosensing, forbliver tvingende emner for igangværende undersøgelser.
I denne sammenhæng står fMPA som en effektiv tilgang til at afsløre omfanget af calciummobilisering under præcist kontrollerede mekaniske kræfter, hvilket muliggør samtidig anvendelse af mekanisk modulering (ved hjælp af mikropipetteaspirationssystemet) og visualisering af calciumintensitet (ved hjælp af fluorescerende indikatorer). Det efterligner især det fysiologiske scenario, når RBC bevæger sig gennem indsnævring af blodkar. Det er værd at bemærke, at det fMPA-system, vi udviklede, kan generere tryk med en opløsning på 1 mmHg. Det implementerede højhastighedskamera kan opnå en tidsmæssig opløsning på 100 ms og en rumlig opløsning på submikronmeterniveau. Disse konfigurationer sikrer præcis anvendelse af mekaniske kræfter på levende celler og fanger samtidig den resulterende cellulære signalering. På grund af den integrerende konstruerede karakter af denne opsætning kan mikropipetteaspirationsanalysen desuden let tilpasses til at supplere andet udstyr eller teknikker, hvilket muliggør yderligere udforskning af cellemekanikkens forviklinger. Denne alsidighed står som en yderligere fordel ved denne tilgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne fra og er godkendt af Human Research Ethics Committee ved University of Sydney. Der blev indhentet informeret samtykke fra donorerne til denne undersøgelse.
1. Isolering af menneskelig RBC
BEMÆRK: Trin 1.1 skal udføres af en uddannet phlebotomist ved hjælp af en protokol, der er godkendt af Institutional Review Board.
- Træk 5 ml blod ud af medianen alen vene med en 19 G sommerfuglenål.
- Overfør det opsamlede blod til et 15 ml rør indeholdende 1:200 enoxaparin for at forhindre koagulation.
- Fortynd 5 μL enoxaparin-antikoaguleret blod i 1 ml carbonat/bicarbonatbuffer (C-buffer, pH = 8,5-9; Tabel over materialer).
- Den fortyndede blodprøve centrifugeres ved 900 × g i 1 min for at sedimentere RBC'erne. Supernatanten dekanteres forsigtigt uden at forstyrre pelletten.
- Udfør to vaske af RBC-pelleten med 1 ml C-buffer (materialetabel), centrifuger hver gang ved 900 × g i 1 min.
- Derefter vaskes RBC-pelleten 2x med 1 ml Tyrodes buffer under anvendelse af de samme centrifugeringsbetingelser, og derefter resuspenderes den endelige pellet i 1 ml Tyrodes buffer for at opnå den vaskede lager RBC-suspension.
2. Indlæsning af calciumindikator
- Koncentrationen af den vaskede stam-RBC-opløsning justeres til 10 × 106 celler/ml i Tyrodes buffer baseret på celletallet opnået ved hjælp af en automatisk celletæller (materialetabel).
- Mærk calcium inde i RBC'erne ved at inkubere med 16,67 μM Cal-520 AM, et calciumfølsomt farvestof, mens du omrører på en roterende rørblander i 1 time.
- Fortynd RBC'erne i Tyrodes buffer indeholdende 0,5% bovint serumalbumin (BSA) i forholdet 1:50. Cellerne er nu klar til eksperimentel brug.
3. Fremstilling af mikropipetter
- Monter borosilikatglaskapillarrøret (1 mm udvendig diameter x 0,6 mm indvendig diameter) på P-1000 mikropipetteaftrækkeren for at producere to tilsvarende mikropipetter med lukkede spidser på trækstedet ved hjælp af det forudindstillede trækprogram. Til denne opsætning skal du bruge følgende trækprogramværdier: varme 516, træk 150, hastighed 75, tid 250 og tryk 500.
BEMÆRK: Opvarmnings- og trækparametre, der er indstillet i trækprogrammet, kan tilpasses og afhænger af de ønskede indstillinger for det eksperimentelle design12. CHECKPOINT (se supplerende tabel S1). - Åbn den lukkede spids ved at montere en af de lukkede mikropipetter, der anskaffes efter træk i mikropipetteskæreren. Opvarmningstemperaturen indstilles til ca. 50-60 °C.
- Find mikropipetten ved hjælp af et 10x okular. Flyt mikropipetten tæt på borosilikatglasperlen ved hjælp af justeringsknapperne.
- Skift okularet til 30x, før mikropipetten placeres så tæt på borosilikatglasperlen som muligt uden at bøje pipettespidsen.
- Blødgør borosilikatglasperlen ved hjælp af varme ved at træde på varmepedalen. Indsæt forsigtigt den rå lukkede mikropipettespids i den blødgjorte perle, indtil det ønskede slutpunkt, åbningsdiameteren, er nået.
- Slip fodpedalen og lad glasperlen køle af. Sørg for, at spidsen af mikropipetten altid forbliver inde i perlen.
BEMÆRK: Indsættelse af spidsen yderligere fører til større åbningsdiametre. - Træk forsigtigt mikropipetten ud, hvilket fører til et klart lige snit på den lukkede mikropipette. Bekræft, at kapillærens endelige diameter er 1 μm.
BEMÆRK: CHECKPOINT (se supplerende tabel S1)
4. Forberedelse af cellekammer
- Brug en diamantblyant til at opdele et standard 40 mm x 22 mm x 0,17 mm glasdæksel i tre lige store strimler.
- Fastgør et stykke af det skårne glasdækselslip til bunden af en hjemmelavet kammerholder med vakuumfedt.
BEMÆRK: Kammerholderen består af to firkanter af metal (kobber/aluminium), der er forbundet med et buet håndtag. Afstanden mellem metalblokkene skal være mindre end 40 mm, for at det afskårne dæksel klæber til holderen og danner et parallelt kammer. - Fastgør det andet stykke af det skårne glasdækselslip til toppen af den hjemmelavede kammerholder med vakuumfedt .
BEMÆRK: CHECKPOINT (se supplerende tabel S1) - 200 μL af den mærkede RBC-suspension injiceres mellem to dæksedler ved hjælp af en 200 μL pipettepistol (figur 1).
Figur 1: Illustration af cellekammeret. To afskårne stykker af en 40 mm x 22 mm x 0,17 mm glasdæksel klæbes til kammerholderen ved hjælp af fedt. Mellem de to slebne glasdæksler podes ca. 200 μL af celleopløsningen i Tyrodes buffer. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Mikropipette aspirationssamling
- Monter cellekammeret på holderscenen, der findes på mikroskopplatformen. Juster positionen, så cellekammeret er direkte over målet (figur 2B).
- Sænk mikropipetteholderen til under væskeniveauet i den tilsluttede vandbeholder.
- Injicer enten demineraliseret vand eller Tyrodes buffer i den fremstillede mikropipette og fjern forsigtigt alle luftbobler ved hjælp af en sprøjte kombineret med en 34 G nål (se tabel over materialer).
- Skru enden af mikropipetteholderen halvvejs af, og lad vandet dryppe fra mikropipetteholderen i et par sekunder.
BEMÆRK: CHECKPOINT (se supplerende tabel S1) - Sæt mikropipetten i holderspidsen. Stram holderskruen for at sikre, at mikropipetten er fastgjort.
- Indsæt mikropipetten i cellekammeret, og find mikropipetten og RBC'erne under mikroskopet. Brug mikromanipulatoren til at justere positionen.
- Sænk mikropipettespidsen yderligere for at sikre, at spidsen er nivelleret med den placerede RBC.
BEMÆRK: CHECKPOINT (se supplerende tabel S1) - Nulstil det hydrauliske tryk ved mikropipettespidsen ved at justere vandbeholderens højde. Hæv derefter vandbeholderen lidt for at generere et subtilt positivt tryk ved spidsen.
6. Udfør fluorescenskoblet mikropipetteaspirationsanalyse
- Tænd for 488 nm fluorescerende excitationslyskilde. Tænd ikke for fluorescenslukkeren på dette tidspunkt for at undgå fotoblegning (figur 2C). Tænd for fluorescenskameraet og det transmitterede kamera.
BEMÆRK: Begge kameraer betjenes ved hjælp af den relevante software (se materialetabellen). - Indstil den ønskede eksponeringstid (100 ms for begge kameraer i denne undersøgelse), interesseområde (ROI), binningstørrelse (ingen for denne undersøgelse) for begge kameraer i softwaren. Åbn panelet til anskaffelse af flere dimensioner for at konfigurere anskaffelsesrammenummeret, 2.000 for denne undersøgelse og lagringsmappen.
BEMÆRK: Anskaffelsesrammenummeret afhænger af det ønskede antal aspirationshændelser, der skal registreres. For 1 aspirationsbegivenhed skal rækkevidden af erhvervelsesnummeret indstilles inden for 100-500, hvilket er ca. 10-50 s. - Find mikropipetten under synsfeltet ved hjælp af mikromanipulatoren.
- Tænd for den pneumatiske trykklemme, inklusive kontrolboksen og klemmesystemet (figur 2A). Sørg for, at kontrolboksen er i EXTRNL-tilstand. Kompenser for ethvert forskudt tryk inde i systemet ved langsomt at dreje knappen.
- Tænd for den separate software, der styrer den pneumatiske klemme. Softwaren har et elektrisk kontrolpanel til styring af den diskrete analoge indgang til klemmesystemet. Trykket styres med en konverteringsfaktor på 20 mV/mmHg.
- Nulstil trykket inde i systemet. Flyt forsigtigt mikropipetten tæt på RBC'erne. Juster vandbeholderens position, indtil der ses et subtilt positivt tryk ved mikropipettespidsen.
- Start anskaffelsen i kameraets betjeningssoftware. Tænd for fluorescenslukkeren.
- Opsug en RBC ved at indtaste den beregnede spændingsstørrelse i kontrolpanelet for at nå det ønskede tryk.
BEMÆRK: Trykket for at aspirere en RBC ligger typisk i området Δp = -5 til -40 mmHg. Der bør være en mærkbar tungeforlængelse inden for mikropipettespidsen (figur 2D). - Hold trykket i en forudindstillet periode; Slip derefter trykket.
- Flyt mikropipetten for at hente den næste celle og gentag eksperimentet.
7. Analyse af fluorescensintensitet
- Indlæs de gemte fluorescensbilleder i analysesoftwaren.
- Juster intensitetstærsklen ved hjælp af fanen Skærmjustering . Gør dette ved enten manuelt at indtaste værdierne eller bruge skyderen til at sikre, at fluorescensbillederne viser en klar kontrast mellem cellen i analysesoftwaren (se supplerende fil 1-supplerende figur S1).
- Rul til tidslinjen nederst i softwaren. Find den udpegede aspirationsbegivenhed.
- Klik på Tilføj nye overflader. Definer analysens ROI.
BEMÆRK: Softwaren giver en guidet fem-trins proces til justering og fuldførelse af segmenteringen (se Supplerende fil 1-supplerende figur S2 og supplerende figur S3).
BEMÆRK: Hold investeringsafkastet så lille som muligt for at spare beregningsressourcer. - Brug skyderen til subtraktion i baggrunden, og juster segmenteringstærsklen ved hjælp af skyderen for at opnå det bedste segmenteringsresultat.
BEMÆRK: Dette betyder, at baggrunden bortset fra aspirationshændelsen skal segmenteres så nøjagtigt som muligt (se supplerende fil 1-supplerende figur S4 og supplerende figur S5). - Tilføj et områdefilter for at udelukke baggrundsstøj (se supplerende fil 1-supplerende figur S6).
BEMÆRK: Dette afsluttes i postprocesfasen. - Vælg fanen statistik | Fanen Detaljeret | Fanen Gennemsnitsværdier . Rul for at finde og vælge intensitetsmiddelværdien (se Supplerende fil 1-supplerende figur S7).
- Eksporter fluorescenssignalsporingen over tid til en .csv fil.
- Åbn den eksporterede csv-fil. Træk baggrundssignalerne, Fb, fra alle målinger.
- Ændringen i calciumintensiteten, ΔFmax, beregnes ved hjælp af ligning (1):
(1)
Hvor ΔFmax er den maksimale calciumintensitetsændring, Fb er baggrundsintensiteten, og F0 er hvileintensiteten.
(1)
Figur 2: Fluorescenskoblet mikropipetteaspirationssamling. (A) En oversigt over fMPA-hardwaresystemet, der indeholder det inverterede mikroskop kombineret med brightfield- og fluorescenskameraerne. Venstre side af billedet viser det hjemmelavede vandmanometer og kontrolboksen, der gør det muligt præcist at indstille trykket på den pneumatiske trykpumpe. B) Mikroskoptrinnet, der viser forsøgscellekammeret og mikromanipulatorsystemet med en enkelt mikropipette. (C) Skematisk oversigt over opsætningen af fMPA-systemet. Samtidig billeddannelse af brightfield (gul) og fluorescens (blå emission, grøn excitation) signaler, der bruger to dikroiske spejle til at lede lysbanerne fra fluorescenslyskilden (blå) til målet og derefter til kameraerne til billeddannelse (grøn). (D) Den øverste række viser brightfield-billederne, mens den nederste række viser fluorescensbillederne. Venstre repræsenterer mikropipettens position før aspiration, når RBC er i ro. Den midterste kolonne snapshots aspirationsprocessen, hvor RBC oplever et undertryk på -40 mmHg. Den højre viser cellemorfologien efter at have oplevet det negative aspirationstryk. Skalabjælke = 5 μm. Forkortelser: fMPA = fluorescenskoblet mikropipetteaspiration; DM = dikroisk spejl; RBC = røde blodlegemer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at etablere mikropipetteaspirationsanalyser konstruerede vi først et brugerdefineret cellekammer bestående af to metalfirkanter (kobber / aluminium) forbundet med et håndtag. To tredje skårne glasdæksler (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) blev fastgjort for at skabe et kammer fyldt med 200 μL RBC'er suspenderet i Tyrodes buffer. Efter introduktion af RBC'er i kammeret blev en skræddersyet borosilikatmikropipette fastgjort på en holder og omhyggeligt placeret i kammeret ved hjælp af en mikromanipulator. Derefter blev mikropipetten bragt tættere på for at fange mål-RBC'en.
Til celleudsugning anvendte metoden en pneumatisk højhastighedstrykklemme til at finjustere det negative aspirationstryk. Fluorescensbilleddannelse blev derefter udført for at undersøge calciummobiliseringen ved de forskellige anvendte negative aspirationstryk.
Ved at bruge fMPA til at undersøge, hvordan RBC'er reagerer på varierende negativt aspirationstryk, afslører vores resultater, at der er et klart proportionalt forhold mellem det anvendte negative tryk og calciumtilstrømningen til stede i den aspirerede RBC. For at bestemme ændringen i calciumintensiteten blev den maksimale intensitet af den enkelte aspirerede celle (Fmax) minus baggrundsintensiteten (Fb) divideret med hvileintensiteten (F0) minus Fb. Der var en tilsvarende stigning i tilstrømningen af calciumioner til RBC'erne, når trykket gradvist blev øget mellem -10 mmHg (figur 3A) til -40 mmHg (figur 3D). Dette tyder på, at RBC'er besidder evnen til at mærke ændringer i deres mekaniske og reagere ved hurtige calciumspecifikke kanalaktiviteter14,15.
Figur 3: Fluorescensbilleddannelse med en grafisk repræsentation af normaliserede intensitetsændringer over tid. Vandret på tværs viser fluorescenssnapshots af RBC'erne i hvile (venstre) og de menneskelige RBC'er, der suges af mikropipetten (midten). Repræsentative spor af RBC'erne, der suges ved flere negative aspirationstryk (Δp), kan ses til højre. Det negative aspirationstryk øges trinvist, begyndende ved (A) Δp = -10 mmHg, (B) Δp = -20 mmHg, (C) Δp = -30 mmHg og (D) Δp = -40 mmHg. Når RBC's tunge forlænges under aspiration, kan der observeres en signifikant calciummobilisering som vist ved den øgede Cal-520 AM foldændring. F/F0 blev brugt til at undersøge calciummobiliseringen inde i den opsugede RBC. Fra ovenstående kurver viste den observerede tendens, at Cal-520 AM-signalet steg proportionalt med stigningen i det anvendte negative aspirationstryk. Skalabjælke = 5 μm. Forkortelse: RBC'er = røde blodlegemer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel S1: Kontrolpunkter for kritiske trin i fMPA-forberedelsesprotokollerne. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: En guidet proces til justering og udførelse af segmentering. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikropipetteaspirationsassays legemliggør en raffineret metode, der anvender betydelig trykmodulation, nøjagtig rumlig orkestrering og pålidelig tidsmæssig skelnen for at undersøge de dybe forviklinger ved cellulær biomekanik. Denne undersøgelse lægger særlig vægt på anvendelsen af fMPA som et afgørende redskab til at afsløre de nuancerede mekanofølsomme reaktioner, der vises af RBC'er under varierende stimuli. Den samtidige brug af brightfield- og fluorescenssignaler muliggjorde en mangesidet udforskning af cellulære fænomener, hvilket fremmede overvågning og påvisning af intracellulær calciumtilstrømning i realtid. Denne tilgang giver et integreret indblik i de komplekse mekanosenserende reaktioner af RBC'er.
Det er vigtigt, at anvendeligheden af fMPA-teknikken strækker sig ud over RBC'er, da den kan anvendes med andre celletyper, der ikke anvender høj mekanisk følsomhed, såsom blodplader og neuroner9. På grund af sin minimale indvirkning på celleintegriteten under eksperimentel håndtering garanterer fMPA desuden bevarelsen af cellens naturlige tilstand, hvilket gør den meget velegnet til brug med primære celler1. Desuden tilbyder fMPA-metoden alsidighed gennem mikropipetternes justerbare geometri, hvilket giver mulighed for en bredere vifte af eksperimentelle designs, der er skræddersyet til specifikke forskningsspørgsmål og effektiv udforskning af forskellige mekaniske forhold.
Med forbedringen i den optiske vej, der forbedrer den samtidige brug af multifluorescensbilleddannelse, muliggør fMPA-systemet desuden realtidsdetektion af intracellulær calciumkoncentration ved aspiration. Denne evne åbner en mulighed for at udforske calciumrelaterede molekyler, såsom den mekanofølsomme ionkanal, PIEZO1, som har vist sig at formidle og opfatte mekaniske signaler fra de ydre miljøer 7,14. Nyere litteratur fremhæver en stigning i membranspænding som en væsentlig faktor, der stimulerer PIEZO1-kanalaktivitet, hvilket efterfølgende letter Ca2+-tilstrømningen6. Dette understreger en afgørende anvendelse af fMPA, som er at undersøge samspillet mellem membranspænding, PIEZO1 og calciumtilstrømning og kaste lys over de indviklede mekanosenseringsprocesser i celler.
Fra et teknisk perspektiv er det værd at nævne, at de to primære komponenter i fMPA-systemet, der er ansvarlige for at generere aspirationskraften (mekaniske stimuli) og udføre fluorescensbilleddannelse i realtid, er henholdsvis den pneumatiske trykpumpe og fluorescenskameraet. Valget af passende pumpe og kamera til systemet bør baseres på den specifikke celletype og biologiske proces, der undersøges. Pumpen, der anvendes i vores system, arbejder inden for et steady-state-trykområde på ± 200 mmHg og kan reagere på kommandoer for trykændringer så betydelige som ± 200 mmHg. Trykstigningstiden og faldtiden bør ikke overstige 6-8 ms for et 20 mmHg trin og 15-20 ms for et 200 mmHg trin. For at sikre kraftopløsning skal HSPC-systemets støjniveau være mindre end ± 0,5 mmHg, peak-to-peak. Disse krav anvendes i denne opsætning; et interval på ± 40 mmHg er imidlertid tilstrækkeligt til at opnå et respons for forsøgsprotokollen15. Med hensyn til fluorescenskameraet valgte vi funktioner med en 95% kvanteeffektivitet og en 11 μm x 11 μm pixelstørrelseschip. Denne følsomme sensorkonfiguration opfanger effektivt fluorescenssignalet ved høj hastighed. Derudover er det afgørende at opretholde en median læsestøj på 1,6e- for et passende signal-støj-forhold under billeddannelse16.
Fra et proceduremæssigt perspektiv kræver udførelse af fMPA et sæt avancerede færdigheder. For eksempel kræver fremstilling af mikropipetter ved hjælp af mikropipetteskæreren præcision og fingerfærdighed sammen med omhyggelig kontrol af temperatur og positionering. Placering af mikropipetten inden for mikroskopets synsfelt kræver en omhyggelig indsats for at undgå beskadigelse af både mikropipettespidsen og cellekammeret. Derudover er en almindelig udfordring forbundet med fluorescensbilleddannelse fotoblegning. For at afhjælpe dette problem er det vigtigt at minimere prøvens eksponeringstid for belysningssystemet. Med henvisning til protokollen »fluorescenskoblet mikropipetteaspirationsassay« forbliver excitationslyskildens fluorescenslukker slukket, indtil alle parametre er indtastet gennem kameraets betjeningssoftware, og aspirationssystemet er klar til forsøg. Først da tændes fluorescenslukkeren for at starte billeddannelsen. For yderligere at reducere fotoblegningen anbefales det at anvende den mindste lyskildeintensitet, der stadig giver tilstrækkelig fluorescensekspression i prøven.
Desuden gør den nuværende manuelle betjening, der kræves til fMPA-assays, denne teknik arbejdskrævende. Som følge heraf stammer de uoverensstemmelser, der kan opstå i dette assay, primært fra operatørafhængige variabler såvel som de faktorer, der er forbundet med variationer i filamentforvarmning og kapillærglasegenskaber. I fremtiden kræver optimering af udførelsen af denne teknik overvejelse af potentielle tandemimplementeringer. For eksempel, når det kombineres med mikrofluidiske enheder, kan mikropipetteaspirationen omdannes til en platform med høj kapacitet, hvilket signifikant øger eksperimenthastigheden fra at studere omkring 20 celler i timen til ca. 1.000 celler / h17,18. Denne inkorporering forbedrer også reproducerbarheden af dataene. Desuden er visse muligheder blevet undersøgt med succes ved at inkorporere automatiserings- og billedanalysesystemer19. Især er finite element analysis (FEA) et beregningsværktøj, der almindeligvis anvendes til at modellere mikropipetteaspirationsassays. FEA kan forudsige det cellulære respons på mekaniske stimuli og karakterisere deres mekaniske egenskaber. Det har potentiale til at optimere mikropipettedesignet og yderligere validere de eksperimentelle resultater19.
Afslutningsvis giver fMPA-tilgangen værdifuld indsigt i RBC'ers mekanofølsomme adfærd ved at reagere på mekaniske stimuli. Denne undersøgelse etablerer en grundlæggende ramme for fremtidige undersøgelser af de indviklede mekanismer for mekanotransduktion inden for RBC'er og på tværs af bredere biologiske systemer. Sådanne undersøgelser rummer store løfter om at fremme vores forståelse af disse mekanismer og optrævle deres omfattende implikationer i forskellige fysiologiske sammenhænge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser at rapportere om denne undersøgelse.
Acknowledgments
Vi takker Nurul Aisha Zainal Abidin og Laura Moldovan for yderligere donorrekruttering, blodindsamling og flebotomistøtte. Vi takker Tomas Anderson og Arian Nasser for at organisere udstyret og reagenserne. Denne forskning blev finansieret af Australian Research Council (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. A.J.); National Health and Medical Research Council (NHMRC) of Australia Ideas Grant (APP2003904-L. A.J.); NHMRC Udstyr Grant-L.A.J.; NSW kardiovaskulært kapacitetsopbygningsprogram (tidlig midtkarriereforsker Grant-LAH); NSW CVRN-VCCRI Research Innovation Grant; Kontoret for Global og Forskningsengagement (Sydney-Glasgow Partnership Collaboration Award-L.A.J.); L.A.J. er National Heart Foundation Future Leader Fellow Level 2 (105863) og Snow Medical Research Foundation Fellow (2022SF176).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µManager | Micro-Manager | Version 2.0.0 | |
| 1 mL Syringe | Terumo | 210320D | Cooperate with the Microfil |
| 200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | Red clood cell preparation |
| 22 x 40 mm Cover Slips | Knittel Glass | MS0014 | Cell chamber assembly |
| 50 mL Syringe | Terumo | 220617E | Connect to the water tower |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000280 | Red clood cell preparation |
| Clexane | Sigma-Aldrich | 1235820 | To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL |
| DAQami | Diligent | ||
| Fluorescence light source | CoolLED | pE-300 | Micropipette aspiration hardware system |
| Glass capillary | Narishige | G-1 | Micropipette manufacture |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Hepes | Thermo Fisher | 15630080 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| High speed GigE camera | Manta | G-040B | Micropipette aspiration hardware system |
| High speed pressure clamp | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
| High speed pressure clamp head stage | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
| Imaris | Oxford Instruments | ||
| Inverted Microscopy | Olympus | Olympus IX83 | Micropipette aspiration hardware system |
| Microfil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip |
| Micropipette Puller | Sutter instrument | P1000 | Micropipette manufacture |
| Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System | Merck Millipore | ZEQ7000T0C | Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation |
| Pipette microforge | Narishige | MF-900 | Micropipette manufacture |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Pressue Pump | Scientific Instrument | PV-PUMP | Induce controlled pressure during experiment |
| Prime 95B Camera | Photometrics | Prime 95B sCMOS | Flourscent imaging |
| Rotary wheel remote unit | Sensapex | uM-RM3 | Control panel for micropipette position adjustment |
| Scepter 3.0 Handheld Cell Counter | Merck Millipore | PHCC340KIT | Automatic cell counter |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) |
Sigma-Aldrich | S9638 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Touch screen control unit | Sensapex | uM-TSC | Control panel for micropipette position adjustment |
| X dry Objective | Olympus | Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL | Micropipette aspiration hardware system |
References
- González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).
- Mierke, C. T. Physics of Cancer, Volume 3 (Second Edition): Experimental biophysical techniques in cancer research. , IOP Publishing. (2021).
- Chen, Y., et al. Loss of the F-BAR protein CIP4 reduces platelet production by impairing membrane-cytoskeleton remodeling. Blood. 122 (10), 1695-1706 (2013).
- Shin, J. -W., Swift, J., Spinler, K. R., Discher, D. E. Myosin-II inhibition and soft 2D matrix maximize multinucleation and cellular projections typical of platelet-producing megakaryocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11458-11463 (2011).
- Liapis, H., Foster, K., Miner, J. H. Red cell traverse through thin glomerular basement membrane. Kidney International. 61 (2), 762-763 (2002).
- Wang, H., et al. Fluorescence-coupled micropipette aspiration assay to examine calcium mobilization caused by red blood cell mechanosensing. European Biophysics Journal. 51 (2), 135-146 (2022).
- Danielczok, J. G., et al. Red blood cell passage of small capillaries is associated with transient Ca2+-mediated adaptations. Frontiers in Physiology. 8, 979 (2017).
- Diez-Silva, M., Dao, M., Han, J., Lim, C. -T., Suresh, S. Shape and biomechanical characteristics of human red blood cells in health and disease. MRS Bulletin. 35 (5), 382-388 (2010).
- Maître, J. -L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. eLife. 5, e15447 (2016).
- Bogdanova, A., Makhro, A., Wang, J., Lipp, P., Kaestner, L. Calcium in red blood cells-a perilous balance. International Journal of Molecular Sciences. 14 (5), 9848-9872 (2013).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018. , Available from: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf (2018).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Sforna, L., et al. Piezo1 controls cell volume and migration by modulating swelling-activated chloride current through Ca2+ influx. Journal of Cellular Physiology. 237 (3), 1857-1870 (2022).
- High speed pressure clamp. ALA Scientific Instruments. , ALA Scientific. Available from: https://alascience.com/products/hspc-2sb/ (2023).
- Teledyne Imaging Prime 95BTM Scientific CMOS Camera Datasheet. , Available from: https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2019/10/Prime-95B-Datasheet-07172020.pdf (2020).
- Lee, L. M., Lee, J. W., Chase, D., Gebrezgiabhier, D., Liu, A. P. Development of an advanced microfluidic micropipette aspiration device for single cell mechanics studies. Biomicrofluidics. 10 (5), 054105 (2016).
- Weaver, W. M., et al.
- Zhou, E. H., Lim, C. T., Quek, S. T. Finite element simulation of the micropipette aspiration of a living cell undergoing large viscoelastic deformation. Mechanics of Advanced Materials and Structures. 12 (6), 501-512 (2005).
- Oh, M. -J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. Micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness. Journal of Visualized Experiments. (67), e3886 (2012).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. Biophysical journal. 4 (4), 303-316 (1964).
- Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
- Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European Physical Journal E. 14 (2), 149-167 (2004).
- Hochmuth, R. M.
- Pu, H., et al. Micropipette aspiration of single cells for both mechanical and electrical characterization. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 66 (11), 3185-3191 (2019).
- Guevorkian, K., Maître, J. -L. Chapter 10 - Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods in Cell Biology. , 187-201 (2017).
- Biro, M., Maître, J. -L. Chapter 14 - Dual pipette aspiration: A unique tool for studying intercellular adhesion. Methods in Cell Biology. 125, 255-267 (2015).
