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Biology

प्रतिदीप्ति माइक्रोपिपेट आकांक्षा परख लाल रक्त कोशिका mechanosensing की जांच करने के लिए

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66265
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1, 1, 1,2,3,4, 1, 1,2,3,4
1School of Biomedical Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4The University of Sydney Nano Institute (Sydney Nano), The University of Sydney

Summary

यांत्रिक तनाव के तहत सेलुलर व्यवहार की खोज सेलुलर यांत्रिकी और मैकेनोबायोलॉजी में प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है। हम प्रतिदीप्ति माइक्रोपिपेट एस्पिरेशन (एफएमपीए) तकनीक पेश करते हैं, जो एकल कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग के व्यापक विश्लेषण के साथ नियंत्रित यांत्रिक उत्तेजना के संयोजन वाली एक उपन्यास विधि है। यह तकनीक लाइव-सेल मैकेनोबायोलॉजी के नए गहन अध्ययन की जांच करती है।

Abstract

माइक्रोपिपेट आकांक्षा परख लंबे समय से लाइव-सेल यांत्रिकी की जांच के लिए आधारशिला रही है, जो यांत्रिक तनाव के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। यह पत्र प्रतिदीप्ति-युग्मित माइक्रोपिपेट आकांक्षा (एफएमपीए) परख के एक अभिनव अनुकूलन का विवरण देता है। एफएमपीए परख आयन चैनलों द्वारा मध्यस्थता वाली लाइव-सेल मैकेनोट्रांसडक्शन प्रक्रियाओं की समवर्ती निगरानी करते हुए सटीक यांत्रिक बलों को प्रशासित करने की क्षमता का परिचय देता है। परिष्कृत सेटअप में एक सटीक-इंजीनियर बोरोसिलिकेट ग्लास माइक्रोपिपेट शामिल है जो एक बारीक विनियमित जल भंडार और वायवीय आकांक्षा प्रणाली से जुड़ा है, जो 1 मिमीएचजी के रूप में परिष्कृत वेतन वृद्धि के साथ नियंत्रित दबाव अनुप्रयोग ± सुविधा प्रदान करता है। एक महत्वपूर्ण वृद्धि एपी-प्रतिदीप्ति इमेजिंग का एकीकरण है, जो आकांक्षा के दौरान सेल रूपात्मक परिवर्तनों और इंट्रासेल्युलर कैल्शियम फ्लक्स के एक साथ अवलोकन और मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। एफएमपीए परख, माइक्रोपिपेट आकांक्षा के साथ एपी-प्रतिदीप्ति इमेजिंग के अपने सहक्रियात्मक संयोजन के माध्यम से, यंत्रवत् चुनौतीपूर्ण वातावरण के भीतर सेल मैकेनोसेंसिंग के अध्ययन के लिए एक नया मानक निर्धारित करता है। यह बहुआयामी दृष्टिकोण विभिन्न प्रयोगात्मक सेटअपों के अनुकूल है, जो एकल-कोशिका तंत्र तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

Introduction

सेलुलर व्यवहार की दुनिया में खुलासा खोजों ने आसंजन, प्रवास और भेदभाव जैसे गतिशील सेलुलर गतिविधियों को निर्धारित करने में यांत्रिक उत्तेजनाओं की भूमिका को बढ़ाया है, जैसे तनाव, द्रव कतरनी तनाव, संपीड़न और सब्सट्रेट कठोरता। इन mechanobiological पहलुओं कैसे कोशिकाओं के साथ बातचीत और उनके शारीरिक वातावरण का जवाब, विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं 1,2 को प्रभावित स्पष्ट करने में सर्वोपरि महत्व के हैं.

पिछले एक दशक में, माइक्रोपिपेट-आधारित आकांक्षा परख यांत्रिक उत्तेजनाओं के लिए विविध सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने में एक बहुमुखी उपकरण के रूप में सामने आए हैं। यह तकनीक एकल-कोशिका स्तर पर जीवित कोशिकाओं के आंतरिक यांत्रिक गुणों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, जिसमें सेलुलर लोचदार मापांक, कठोरता और कॉर्टिकल तनाव शामिल हैं। ये परख विभिन्न यांत्रिक मापदंडों के माप को सक्षम करते हैं, जैसे कोशिका झिल्ली तनाव, कोशिका झिल्ली पर लगाया गया दबाव, और कॉर्टिकल तनाव (तालिका 1में संक्षेपित)। आकांक्षात्मक बलों का अध्ययन कैसे वे सेलुलर कार्यों और प्रक्रियाओं को प्रभावित, विशेष रूप से झिल्ली गतिशीलता के दायरे में, विखंडन, बढ़ाव, और नवोदित 3,4 सहित की हमारी समझ को समृद्ध किया है.

यांत्रिक पैरामीटर या क़िस्‍म मौलिक दृष्टिकोण
सेल कठोरता सेल की यांत्रिक कठोरता और लोच का मापन। कोशिका झिल्ली की आकांक्षा और नकारात्मक दबाव20,21 के लिए विरूपण प्रतिक्रिया का विश्लेषण.
आसंजन शक्ति कोशिकाओं को सतहों का पालन करने के तरीके का मूल्यांकन। एक सब्सट्रेट2,22 से पालन कोशिकाओं को अलग करने के लिए नियंत्रित चूषण के आवेदन.
झिल्ली तनाव कोशिका झिल्ली के भीतर तनाव या तनाव का आकलन। लागू दबाव23,24 के जवाब में झिल्ली विरूपण का मापन.
विस्कोइलास्टिक गुण एक सेल के संयुक्त चिपचिपा और लोचदार व्यवहार की विशेषता। आकांक्षा23,25 के लिए समय पर निर्भर विरूपण प्रतिक्रिया का विश्लेषण.
विकृति यह निर्धारित करना कि कोई कक्ष कितनी आसानी से आकार बदल सकता है. नियंत्रित चूषण20,24 के तहत विरूपण की सीमा का मूल्यांकन.
पृष्ठीय तनाव कोशिका की सतह पर तनाव का मापन. एक माइक्रोपिपेट झिल्ली फलाव बनाने के लिए आवश्यक दबाव का आकलन26.
सेल-सामग्री इंटरैक्शन कोशिकाओं और सामग्रियों या सब्सट्रेट के बीच बातचीत का अध्ययन। विभिन्न सामग्रियों के संपर्क में कोशिकाओं की आकांक्षा और बातचीत का अवलोकन2,24.
सेल-सेल इंटरैक्शन पड़ोसी कोशिकाओं के बीच बातचीत की परीक्षा। कोशिकाओं के एक समूह की आकांक्षा और उनके अंतरकोशिकीय बलों का विश्लेषण27.

तालिका 1: माइक्रोपिपेट आकांक्षा परख द्वारा विशेषता यांत्रिक पैरामीटर।

माइक्रोपिपेट-आधारित आकांक्षा तकनीक का व्यापक रूप से लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है, जो आरबीसी की विकृति और विभिन्न यांत्रिक विशेषताओं का आकलन करता है, जो संचार प्रणाली में उनके कार्य को समझने में आवश्यक है। आरबीसी उल्लेखनीय अनुकूलनशीलता प्रदर्शित करते हैं, जटिल केशिका नेटवर्क और अंतर-एंडोथेलियल फांक 5,6 के माध्यम से नेविगेट करते समय विरूपण के खिलाफ अपनी यांत्रिक बहुमुखी प्रतिभा को संरक्षित करते हैं। इस यात्रा के दौरान, आरबीसी को 0.5-1.0 माइक्रोन के रूप में संकीर्ण मार्ग के माध्यम से पार करना चाहिए, खुद को तनाव और संपीड़न 7,8,9 सहित यांत्रिक बलों की एक भीड़ के अधीन करना चाहिए। वे भी परिसंचरण10 के दौरान रक्त प्रवाह द्वारा उत्पन्न कतरनी तनाव के लिए उच्च संवेदनशीलता है. इन प्रक्रियाओं कैल्शियम प्रवाह शामिल नियामक तंत्र की सक्रियता को बढ़ावा देने, यांत्रिकउत्तेजनाओं 11,12 के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं में अच्छी तरह से स्थापित भूमिकाओं के साथ एक महत्वपूर्ण संकेत घटना. कैल्शियम-मध्यस्थता वाले मैकेनोसेंसिंग को नियंत्रित करने वाले जटिल तंत्र चल रही जांच के सम्मोहक विषय बने हुए हैं।

इस संदर्भ में, एफएमपीए ठीक नियंत्रित यांत्रिक बलों के तहत कैल्शियम जुटाने की सीमा को प्रकट करने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण के रूप में खड़ा है, जो यांत्रिक मॉड्यूलेशन (माइक्रोपिपेट आकांक्षा प्रणाली का उपयोग करके) और कैल्शियम तीव्रता के दृश्य (फ्लोरोसेंट संकेतकों का उपयोग करके) के एक साथ आवेदन की अनुमति देता है। यह विशेष रूप से शारीरिक परिदृश्य की नकल करता है जब आरबीसी रक्त वाहिकाओं को संकुचित करने के माध्यम से यात्रा करता है। यह ध्यान देने योग्य है कि हमारे द्वारा विकसित fMPA प्रणाली 1 mmHg के रिज़ॉल्यूशन के साथ दबाव उत्पन्न कर सकती है। कार्यान्वित हाई-स्पीड कैमरा 100 एमएस के अस्थायी रिज़ॉल्यूशन और सबमाइक्रोन-मीटर स्तर पर एक स्थानिक रिज़ॉल्यूशन प्राप्त कर सकता है। ये विन्यास जीवित कोशिकाओं के लिए यांत्रिक बलों के सटीक अनुप्रयोग को सुनिश्चित करते हैं और साथ ही परिणामस्वरूप सेलुलर सिग्नलिंग को पकड़ते हैं। इसके अलावा, इस सेटअप की एकीकृत इंजीनियर प्रकृति के कारण, माइक्रोपिपेट आकांक्षा परख को अन्य उपकरणों या तकनीकों के पूरक के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, जिससे सेल यांत्रिकी की पेचीदगियों की आगे की खोज को सक्षम किया जा सकता है। यह बहुमुखी प्रतिभा इस दृष्टिकोण के एक अतिरिक्त लाभ के रूप में खड़ी है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल सिडनी विश्वविद्यालय के मानव अनुसंधान आचार समिति के दिशानिर्देशों का पालन करता है और इसे अनुमोदित किया गया है। इस अध्ययन के लिए दाताओं से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. मानव आरबीसी अलगाव

नोट: चरण 1.1 संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक प्रशिक्षित फ्लेबोटोमिस्ट द्वारा किया जाना चाहिए।

  1. एक 19 जी तितली सुई का उपयोग माध्यिका क्यूबिटल नस से रक्त के 5 एमएल निकालें.
  2. एकत्रित रक्त को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें थक्के को रोकने के लिए 1:200 एनोक्सापारिन होता है।
  3. कार्बोनेट / बाइकार्बोनेट बफर के 1 एमएल में एनोक्सापारिन-एंटीकोआगुलेटेड रक्त के 5 माइक्रोन को पतला करें (सी-बफर, पीएच = 8.5-9; सामग्री की तालिका)।
  4. आरबीसी तलछट के लिए 1 मिनट के लिए 900 × ग्राम पर पतला रक्त का नमूना अपकेंद्रित्र। गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला ध्यान से छानना।
  5. सी-बफर (सामग्री की तालिका) के 1 एमएल के साथ आरबीसी गोली के दो वॉश करें, हर बार 1 मिन के लिए 900 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग।
  6. इसके बाद, आरबीसी गोली 2x को उसी सेंट्रीफ्यूजेशन स्थितियों का उपयोग करके टायरोड के बफर के 1 एमएल के साथ धोएं और फिर धोए गए स्टॉक आरबीसी निलंबन प्राप्त करने के लिए टायरोड के बफर के 1 एमएल में अंतिम गोली को फिर से निलंबित करें।

2. कैल्शियम सूचक लोड हो रहा है

  1. एक स्वचालित सेल काउंटर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके प्राप्त सेल गणना के आधार पर, टायरोड के बफर में धोए गए स्टॉक आरबीसी समाधान की एकाग्रता को 10 ×10 6 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें।
  2. 1 घंटे के लिए रोटरी ट्यूब मिक्सर पर आंदोलन करते हुए, 16.67 माइक्रोन कैल -520 एएम, कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई के साथ इनक्यूबेट करके आरबीसी के अंदर कैल्शियम को लेबल करें।
  3. टायरोड के बफर में आरबीसी को पतला करें जिसमें 1:50 के अनुपात में 0.5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) होता है। कोशिकाएं अब प्रयोगात्मक उपयोग के लिए तैयार हैं।

3. माइक्रोपिपेट निर्माण

  1. प्रीसेट पुलिंग प्रोग्राम का उपयोग करके पुलिंग साइट पर बंद युक्तियों के साथ दो संबंधित माइक्रोपिपेट का उत्पादन करने के लिए P-1000 माइक्रोपिपेट पुलर पर बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका ट्यूब (1 मिमी बाहरी व्यास x 0.6 मिमी आंतरिक व्यास) को माउंट करें। इस सेटअप के लिए, निम्न पुलिंग प्रोग्राम मानों का उपयोग करें: हीट 516, पुल 150, वेग 75, समय 250, और दबाव 500।
    नोट: खींचने वाले कार्यक्रम में सेट हीटिंग और खींचने वाले मापदंडों को अनुकूलित किया जा सकता है और प्रयोगात्मक डिजाइन12 की वांछित सेटिंग्स पर निर्भर हैं। चेकपॉइंट ( पूरक तालिका S1 देखें)।
  2. माइक्रोपिपेट कटर पर खींचने के बाद खरीदे गए क्लोज-एंडेड माइक्रोपिपेट में से एक को माउंट करके बंद टिप खोलें। हीटिंग तापमान को लगभग 50-60 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें।
  3. एक 10x ऐपिस का उपयोग कर micropipette का पता लगाएँ. समायोजन के लिए knobs का उपयोग करके बोरोसिलिकेट कांच मनका के करीब micropipette ले जाएँ.
  4. विंदुक टिप झुकने के बिना संभव के रूप में बोरोसिलिकेट ग्लास मनका के करीब के रूप में माइक्रोपिपेट की स्थिति से पहले ऐपिस को 30x में बदलें।
  5. हीटिंग पेडल पर कदम रखकर गर्मी का उपयोग करके बोरोसिलिकेट ग्लास मनका को नरम करें। धीरे नरम मनका में कच्चे बंद माइक्रोपिपेट टिप डालें जब तक वांछित समापन बिंदु, उद्घाटन व्यास, तक पहुँच गया है.
  6. पैर पेडल छोड़ें और कांच मनका ठंडा करते हैं. सुनिश्चित करें कि माइक्रोपिपेट की नोक हमेशा मनका के अंदर रहती है।
    नोट: टिप डालने से आगे बड़े उद्घाटन व्यास होते हैं।
  7. धीरे micropipette निकालने, बंद micropipette पर एक स्पष्ट सीधे कटौती करने के लिए अग्रणी. पुष्टि करें कि केशिका का अंतिम व्यास 1 माइक्रोन है।
    नोट: चेकपॉइंट ( पूरक तालिका S1 देखें)

4. सेल कक्ष तैयारी

  1. एक मानक 40 मिमी x 22 मिमी x 0.17 मिमी ग्लास कवरस्लिप को तीन बराबर स्ट्रिप्स में विभाजित करने के लिए एक हीरे की पेंसिल का उपयोग करें।
  2. वैक्यूम ग्रीस के साथ एक घर का बना चैम्बर धारक के नीचे कट ग्लास कवरस्लिप के एक टुकड़े का पालन करें।
    नोट: चैम्बर धारक में दो धातु (तांबा/एल्यूमीनियम) वर्ग होते हैं जो एक घुमावदार हैंडल से जुड़े होते हैं। धातु ब्लॉकों के बीच की दूरी एक समानांतर कक्ष बनाने के लिए धारक का पालन करने के लिए कट कवरस्लिप के लिए 40 मिमी से कम होनी चाहिए।
  3. वैक्यूम ग्रीस के साथ घर के बने कक्ष धारक के शीर्ष पर कटे हुए ग्लास कवरस्लिप के दूसरे टुकड़े का पालन करें।
    नोट: चेकपॉइंट ( पूरक तालिका S1 देखें)
  4. एक 200 माइक्रोन विंदुक बंदूक (चित्रा 1) का उपयोग कर दो coverslips के बीच लेबल आरबीसी निलंबन के 200 माइक्रोन इंजेक्षन.

Figure 1
चित्रा 1: सेल कक्ष का चित्रण। 40 मिमी x 22 मिमी x 0.17 मिमी ग्लास कवर पर्ची के दो कटे हुए टुकड़े ग्रीस का उपयोग करके चैम्बर धारक का पालन करते हैं। दो कट ग्लास कवरस्लिप के बीच, टायरोड के बफर में सेल समाधान के लगभग 200 माइक्रोन को वरीयता दी जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. माइक्रोपिपेट आकांक्षा विधानसभा

  1. माइक्रोस्कोप मंच पर मौजूद धारक मंच पर सेल कक्ष माउंट. स्थिति को समायोजित करें ताकि सेल कक्ष सीधे उद्देश्य (चित्रा 2 बी) से ऊपर हो।
  2. माइक्रोपिपेट धारक को जुड़े जलाशय के द्रव स्तर से नीचे करें।
  3. गढ़े micropipette में या तो demineralized पानी या Tyrode बफर इंजेक्षन और ध्यान से एक 34 जी सुई (सामग्री की तालिका) के साथ युग्मित एक सिरिंज का उपयोग कर सभी हवाई बुलबुले को हटा दें.
  4. माइक्रोपिपेट होल्डर के सिरे को आधा खोल दें और पानी को कुछ सेकंड के लिए माइक्रोपिपेट होल्डर से टपकने दें।
    नोट: चेकपॉइंट ( पूरक तालिका S1 देखें)
  5. माइक्रोपिपेट को होल्डर टिप में डालें। माइक्रोपिपेट तय हो गया है सुनिश्चित करने के लिए धारक पेंच कस लें।
  6. सेल कक्ष में माइक्रोपिपेट डालें और माइक्रोस्कोप के नीचे माइक्रोपिपेट और आरबीसी का पता लगाएं। स्थिति को समायोजित करने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करें।
  7. माइक्रोपिपेट टिप को और कम करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि टिप स्थित आरबीसी के साथ समतल है।
    नोट: चेकपॉइंट ( पूरक तालिका S1 देखें)
  8. जल भंडार की ऊंचाई को समायोजित करके माइक्रोपिपेट टिप पर हाइड्रोलिक दबाव शून्य करें। फिर, टिप पर एक सूक्ष्म सकारात्मक दबाव उत्पन्न करने के लिए जलाशय को थोड़ा ऊपर उठाएं।

6. प्रतिदीप्ति युग्मित माइक्रोपिपेट आकांक्षा परख करें

  1. 488 एनएम फ्लोरोसेंट उत्तेजना प्रकाश स्रोत चालू करें। फोटोब्लीचिंग (चित्रा 2सी) से बचने के लिए इस स्तर पर प्रतिदीप्ति शटर पर स्विच न करें। प्रतिदीप्ति कैमरा और प्रेषित कैमरा चालू करें।
    नोट: दोनों कैमरे उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके संचालित होते हैं ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. सॉफ्टवेयर में दोनों कैमरों के लिए वांछित एक्सपोजर समय (इस अध्ययन में दोनों कैमरों के लिए 100 एमएस), ब्याज का क्षेत्र (आरओआई), बिनिंग आकार (इस अध्ययन के लिए कोई नहीं) सेट करें। इस अध्ययन के लिए अधिग्रहण फ्रेम संख्या, 2,000 और बचत निर्देशिका स्थापित करने के लिए बहु-आयाम अधिग्रहण पैनल खोलें।
    नोट: अधिग्रहण फ्रेम संख्या दर्ज की जाने वाली आकांक्षा घटनाओं की वांछित संख्या पर निर्भर है। 1 आकांक्षा घटना के लिए, अधिग्रहण संख्या की सीमा 100-500 के भीतर निर्धारित की जानी चाहिए, जो लगभग 10-50 एस है।
  3. माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके देखने के क्षेत्र के तहत माइक्रोपिपेट खोजें।
  4. वायवीय दबाव क्लैंप चालू करें, जिसमें नियंत्रण बॉक्स और क्लैंप सिस्टम(चित्रा 2ए)शामिल हैं। सुनिश्चित करें कि नियंत्रण बॉक्स EXTRNL मोड में है। धीरे-धीरे घुंडी को घुमाकर सिस्टम के अंदर किसी भी ऑफसेट दबाव की भरपाई करें।
  5. वायवीय क्लैंप को नियंत्रित करने वाले अलग सॉफ़्टवेयर को चालू करें। सॉफ्टवेयर में क्लैंप सिस्टम में असतत एनालॉग इनपुट को नियंत्रित करने के लिए एक विद्युत नियंत्रण कक्ष है। दबाव को 20 mV/mmHg रूपांतरण कारक के साथ नियंत्रित किया जाता है।
  6. सिस्टम के अंदर दबाव को शून्य करें। आरबीसी के करीब माइक्रोपिपेट को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। जलाशय की स्थिति को तब तक समायोजित करें जब तक कि माइक्रोपिपेट टिप पर सूक्ष्म सकारात्मक दबाव न देखा जाए।
  7. कैमरा-ऑपरेटिंग सॉफ़्टवेयर में अधिग्रहण शुरू करें। प्रतिदीप्ति शटर पर स्विच करें।
  8. वांछित दबाव तक पहुंचने के लिए नियंत्रण कक्ष में गणना किए गए वोल्टेज परिमाण में टाइप करके एक आरबीसी को महाप्राण करें।
    नोट: आरबीसी को एस्पिरेट करने का दबाव आमतौर पर Δp = -5 से -40 mmHg की सीमा में होता है। माइक्रोपिपेट टिप (चित्रा 2 डी) के भीतर एक ध्यान देने योग्य जीभ बढ़ाव होना चाहिए।
  9. एक पूर्व निर्धारित अवधि के लिए दबाव पकड़ो; फिर, दबाव छोड़ दें।
  10. अगले सेल लेने के लिए micropipette ले जाएँ और प्रयोग दोहराने.

7. प्रतिदीप्ति तीव्रता विश्लेषण

  1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर में बचाया प्रतिदीप्ति छवियों लोड.
  2. प्रदर्शन समायोजन टैब का उपयोग करके तीव्रता सीमा समायोजित करें। या तो मैन्युअल रूप से मूल्यों को इनपुट या प्रतिदीप्ति छवियों विश्लेषण सॉफ्टवेयर में सेल का एक स्पष्ट विपरीत दिखाने के लिए स्लाइडर का उपयोग करके ऐसा करें (पूरक फ़ाइल 1-पूरक चित्रा एस 1 देखें).
  3. सॉफ़्टवेयर के नीचे टाइमलाइन पर स्क्रॉल करें। निर्दिष्ट आकांक्षा घटना का पता लगाएँ।
  4. नई साइटें जोड़ें पर क्लिक करें. विश्लेषण ROI को परिभाषित करें।
    नोट: सॉफ्टवेयर समायोजित करने और विभाजन को पूरा करने के लिए एक निर्देशित पांच कदम प्रक्रिया प्रदान करता है ( पूरक फ़ाइल 1 पूरक चित्रा एस 2 और पूरक चित्रा एस 3 देखें).
    नोट: कम्प्यूटेशनल संसाधनों को बचाने के लिए आरओआई को जितना संभव हो उतना छोटा रखें।
  5. पृष्ठभूमि घटाव स्लाइडर का उपयोग करें और सबसे अच्छा विभाजन परिणाम प्राप्त करने के लिए स्लाइडर का उपयोग कर विभाजन सीमा को समायोजित.
    नोट: इसका मतलब यह है कि आकांक्षा घटना के अलावा, पृष्ठभूमि को यथासंभव सटीक रूप से खंडित किया जाना चाहिए ( पूरक फ़ाइल 1-पूरक चित्रा एस 4 और पूरक चित्रा एस 5 देखें)।
  6. पृष्ठभूमि शोर को बाहर करने के लिए एक क्षेत्र फ़िल्टर जोड़ें ( पूरक फ़ाइल 1-पूरक चित्रा S6 देखें)।
    नोट: यह पोस्ट प्रक्रिया चरण में पूरा हो गया है।
  7. आंकड़ा टैब चुनें | विस्तृत टैब | औसत मान टैब। खोजने के लिए स्क्रॉल करें और तीव्रता मतलब का चयन करें (पूरक फ़ाइल 1-पूरक चित्रा S7 देखें).
  8. एक .csv फ़ाइल के लिए समय के साथ प्रतिदीप्ति संकेत ट्रेस निर्यात करें.
  9. निर्यात की गई csv फ़ाइल खोलें। पृष्ठभूमि संकेतों घटाना, एफबी, सभी मापों से.
  10. समीकरण (1) का उपयोग करके कैल्शियम तीव्रता परिवर्तन, ΔFअधिकतम की गणना करें:
    Equation 1(1)
    जहां ΔFअधिकतम कैल्शियम तीव्रता परिवर्तन है, Fb, पृष्ठभूमि की तीव्रता है, और F0 आराम की तीव्रता है।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिदीप्ति-युग्मित माइक्रोपिपेट आकांक्षा विधानसभा। (ए) ब्राइटफील्ड और प्रतिदीप्ति कैमरों के साथ संयुक्त उल्टे माइक्रोस्कोप को शामिल करने वाले एफएमपीए हार्डवेयर सिस्टम का अवलोकन। छवि के बाईं ओर घर का बना पानी मैनोमीटर और नियंत्रण बॉक्स को दर्शाया गया है जो वायवीय दबाव पंप के दबाव को ठीक से ट्यून करने की अनुमति देता है। (बी) माइक्रोस्कोप चरण एक एकल माइक्रोपिपेट के साथ प्रयोग सेल कक्ष और माइक्रोमैनिपुलेटर सिस्टम का चित्रण करता है। (सी) एफएमपीए सिस्टम सेटअप का योजनाबद्ध। ब्राइटफील्ड (पीला) और प्रतिदीप्ति (नीला उत्सर्जन, हरी उत्तेजना) संकेतों की समवर्ती इमेजिंग दो डाइक्रोइक दर्पणों का उपयोग करके प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत (नीला) से प्रकाश पथ को लक्ष्य तक निर्देशित करने के लिए, फिर इमेजिंग (हरा) के लिए कैमरों के लिए। (डी) शीर्ष पंक्ति ब्राइटफील्ड छवियों को दर्शाती है जबकि नीचे की पंक्ति प्रतिदीप्ति छवियों को दर्शाती है। बाईं ओर आकांक्षा से पहले माइक्रोपिपेट की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है जब आरबीसी आराम पर होता है। मध्य स्तंभ आकांक्षा प्रक्रिया को स्नैपशॉट करता है जहां आरबीसी -40 मिमीएचजी के नकारात्मक दबाव का अनुभव करता है। नकारात्मक आकांक्षा दबाव का अनुभव करने के बाद सही सेल आकृति विज्ञान को दर्शाता है। स्केल बार = 5 माइक्रोन. संक्षिप्ताक्षर: fMPA = प्रतिदीप्ति-युग्मित माइक्रोपिपेट आकांक्षा; डीएम = डाइक्रोइक दर्पण; आरबीसी = लाल रक्त कोशिका। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

माइक्रोपिपेट आकांक्षा परख स्थापित करने के लिए, हमने पहले एक कस्टम सेल कक्ष का निर्माण किया जिसमें एक हैंडल से जुड़े दो धातु वर्ग (तांबा / टायरोड के बफर में निलंबित आरबीसी के 200 माइक्रोन से भरा एक कक्ष बनाने के लिए दो तीसरे-कट ग्लास कवरस्लिप (40 मिमी × 7 मिमी × 0.17 मिमी) चिपकाए गए थे। आरबीसी को कक्ष में पेश करने के बाद, एक अनुरूप बोरोसिलिकेट माइक्रोपिपेट को एक धारक पर सुरक्षित किया गया था और माइक्रो-मैनिपुलेटर का उपयोग करके कक्ष के भीतर सावधानीपूर्वक तैनात किया गया था। इसके बाद, लक्ष्य आरबीसी को पकड़ने के लिए माइक्रोपिपेट को करीब लाया गया।

सेल आकांक्षा के लिए, विधि ने नकारात्मक आकांक्षा दबाव को ठीक करने के लिए एक वायवीय उच्च गति दबाव क्लैंप का उपयोग किया। प्रतिदीप्ति इमेजिंग तो लागू विभिन्न नकारात्मक आकांक्षा दबाव पर कैल्शियम जुटाने की जांच करने के लिए आयोजित किया गया था.

एफएमपीए का उपयोग करके यह जांचने के लिए कि आरबीसी अलग-अलग नकारात्मक आकांक्षा दबावों का जवाब कैसे देते हैं, हमारे निष्कर्षों से पता चलता है कि लागू नकारात्मक दबाव और एस्पिरेटेड आरबीसी में मौजूद कैल्शियम प्रवाह के बीच एक स्पष्ट आनुपातिक संबंध है। कैल्शियम तीव्रता परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए, एकल महाप्राण कोशिका (एफअधिकतम) की अधिकतम तीव्रता माइनस पृष्ठभूमि तीव्रता (एफबी) को आराम तीव्रता (एफ0) माइनस एफबी से विभाजित किया गया था। आरबीसी में कैल्शियम आयनों की आमद में एक समान वृद्धि हुई थी जब -10 मिमीएचजी(चित्रा 3ए)से -40 मिमीएचजी(चित्रा 3डी)के बीच दबाव में वृद्धि हुई थी। इससे पता चलता है कि आरबीसी उनके यांत्रिक में परिवर्तन भावना और तेजी से कैल्शियम विशिष्ट चैनल गतिविधियों14,15 द्वारा प्रतिक्रिया करने की क्षमता के अधिकारी.

Figure 3
चित्रा 3: समय के खिलाफ सामान्यीकृत तीव्रता परिवर्तन के चित्रमय प्रतिनिधित्व के साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग। क्षैतिज रूप से आरबीसी के प्रतिदीप्ति स्नैपशॉट को आराम से (बाएं) और मानव आरबीसी को माइक्रोपिपेट (मध्य) द्वारा एस्पिरेट किया जा रहा है। कई नकारात्मक आकांक्षा दबावों (Δp) पर आकांक्षा किए जा रहे RBC के प्रतिनिधि निशान दाईं ओर देखे जा सकते हैं। नकारात्मक आकांक्षा दबाव वृद्धिशील रूप से बढ़ जाता है, (ए) Δp = -10 mmHg, (B) Δp = -20 mmHg, (C) Δp = -30 mmHg, और (D) Δp = -40 mmHg से शुरू होता है। जब आकांक्षा के दौरान आरबीसी की जीभ लम्बी हो जाती है, तो एक महत्वपूर्ण कैल्शियम जुटाव देखा जा सकता है जैसा कि बढ़े हुए कैल -520 एएम गुना परिवर्तन द्वारा दिखाया गया है। एफ 0 का उपयोग एस्पिरेटेड आरबीसी के अंदर कैल्शियम जुटाने की जांच के लिए किया गया था। उपरोक्त वक्रों से, देखी गई प्रवृत्ति ने प्रदर्शित किया कि कैल -520 एएम सिग्नल लागू नकारात्मक आकांक्षा दबाव की वृद्धि के साथ आनुपातिक रूप से बढ़ गया। स्केल बार = 5 माइक्रोन. संक्षिप्तीकरण: आरबीसी = लाल रक्त कोशिका। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: एफएमपीए तैयारी प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों के लिए चेकपॉइंट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: विभाजन को समायोजित करने और निष्पादित करने के लिए एक निर्देशित प्रक्रिया। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

माइक्रोपिपेट आकांक्षा परख एक परिष्कृत पद्धति का प्रतीक है, सेलुलर बायोमैकेनिक्स की गहन पेचीदगियों की जांच के लिए पर्याप्त दबाव मॉड्यूलेशन, सटीक स्थानिक ऑर्केस्ट्रेशन और विश्वसनीय लौकिक विवेक को तैनात करता है। यह अध्ययन अलग-अलग उत्तेजनाओं के तहत आरबीसी द्वारा प्रदर्शित सूक्ष्म मेकेनोसेंसिटिव प्रतिक्रियाओं का अनावरण करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में एफएमपीए के आवेदन पर विशेष जोर देता है। ब्राइटफील्ड और प्रतिदीप्ति संकेतों के समवर्ती उपयोग ने सेलुलर घटनाओं के बहुआयामी अन्वेषण को सक्षम किया, वास्तविक समय में इंट्रासेल्युलर कैल्शियम प्रवाह की निगरानी और पता लगाने को आगे बढ़ाया। यह दृष्टिकोण आरबीसी की जटिल मशीनसेंसिंग प्रतिक्रियाओं में एक एकीकृत अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

महत्वपूर्ण बात, fMPA तकनीक की प्रयोज्यता आरबीसी से परे फैली हुई है, क्योंकि इसे अन्य सेल प्रकारों के साथ नियोजित किया जा सकता है जो उच्च यांत्रिक संवेदनशीलता, जैसे प्लेटलेट्स और न्यूरॉन्स9 को अस्वीकार करते हैं। इसके अलावा, प्रयोगात्मक हैंडलिंग के दौरान सेल अखंडता पर इसके न्यूनतम प्रभाव के कारण, एफएमपीए सेल की प्राकृतिक स्थिति के संरक्षण की गारंटी देता है, जिससे यह प्राथमिक कोशिकाओं1 के साथ उपयोग के लिए अत्यधिक उपयुक्त हो जाता है। इसके अलावा, एफएमपीए विधि माइक्रोपिपेट की ट्यूनेबल ज्यामिति के माध्यम से बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करती है, जिससे विशिष्ट शोध प्रश्नों और विभिन्न यांत्रिक स्थितियों के प्रभावी अन्वेषण के अनुरूप प्रयोगात्मक डिजाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला की अनुमति मिलती है।

इसके अतिरिक्त, ऑप्टिकल मार्ग में सुधार के साथ जो बहु-प्रतिदीप्ति इमेजिंग के एक साथ उपयोग को बढ़ाता है, एफएमपीए प्रणाली आकांक्षा पर इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता के वास्तविक समय का पता लगाने की अनुमति देती है। यह क्षमता कैल्शियम से संबंधित अणुओं का पता लगाने का अवसर खोलती है, जैसे कि मैकेनोसेंसिटिव आयन चैनल, PIEZO1, जिसे बाहरी वातावरण 7,14 से यांत्रिक संकेतों को मध्यस्थता और समझने के लिए दिखाया गया है। हाल के साहित्य में झिल्ली तनाव में वृद्धि को PIEZO1 चैनल गतिविधि को उत्तेजित करने वाले एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में उजागर किया गया है, बाद में Ca2+ प्रवाह6 की सुविधा प्रदान करता है। यह fMPA के एक महत्वपूर्ण अनुप्रयोग को रेखांकित करता है, जो झिल्ली तनाव, PIEZO1 और कैल्शियम प्रवाह के बीच परस्पर क्रिया की जांच करना है, जो कोशिकाओं के भीतर जटिल मैकेनोसेंसिंग प्रक्रियाओं पर प्रकाश डालता है।

तकनीकी दृष्टिकोण से, यह ध्यान देने योग्य है कि एफएमपीए प्रणाली के दो प्राथमिक घटक, आकांक्षा बल (यांत्रिक उत्तेजनाओं) को उत्पन्न करने और वास्तविक समय प्रतिदीप्ति इमेजिंग का संचालन करने के लिए जिम्मेदार हैं, क्रमशः वायवीय दबाव पंप और प्रतिदीप्ति कैमरा हैं। सिस्टम के लिए उपयुक्त पंप और कैमरे का चयन अध्ययन के तहत विशिष्ट सेल प्रकार और जैविक प्रक्रिया पर आधारित होना चाहिए। हमारे सिस्टम में नियोजित पंप ± 200 mmHg की स्थिर-अवस्था दबाव सीमा के भीतर संचालित होता है और 200 mmHg ± के रूप में महत्वपूर्ण दबाव परिवर्तन के लिए आदेशों का जवाब दे सकता है। दबाव वृद्धि का समय और गिरावट का समय 20 mmHg चरण के लिए 6-8 ms और 200 mmHg चरण के लिए 15-20 ms से अधिक नहीं होना चाहिए। बल संकल्प सुनिश्चित करने के लिए, एचएसपीसी प्रणाली का शोर स्तर ± 0.5 मिमीएचजी, पीक-टू-पीक से कम होना चाहिए। इन आवश्यकताओं को इस सेटअप में लागू किया जाता है; हालांकि, ± 40 mmHg की एक सीमा प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल15 के लिए एक प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है. प्रतिदीप्ति कैमरे के बारे में, हम एक 95% क्वांटम दक्षता और एक 11 माइक्रोन एक्स 11 माइक्रोन पिक्सेल आकार चिप सुविधाओं का चयन. यह संवेदनशील सेंसर कॉन्फ़िगरेशन उच्च गति पर प्रतिदीप्ति संकेत को कुशलता से कैप्चर करता है। इसके अतिरिक्त, इमेजिंग16 के दौरान पर्याप्त सिग्नल-टू-शोर अनुपात के लिए 1.6ई-के औसत पढ़ने वाले शोर को बनाए रखना महत्वपूर्ण है।

प्रक्रियात्मक दृष्टिकोण से, fMPA को निष्पादित करने के लिए उन्नत कौशल के एक सेट की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, माइक्रोपिपेट कटर का उपयोग करके माइक्रोपिपेट को क्राफ्ट करना तापमान और स्थिति के सावधानीपूर्वक नियंत्रण के साथ-साथ सटीकता और निपुणता की मांग करता है। माइक्रोस्कोप के देखने के क्षेत्र के भीतर माइक्रोपिपेट की स्थिति को माइक्रोपिपेट टिप और सेलुलर कक्ष दोनों को नुकसान से बचने के लिए सावधानीपूर्वक प्रयास की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, प्रतिदीप्ति इमेजिंग से जुड़ी एक आम चुनौती फोटोब्लीचिंग है। इस समस्या को कम करने के लिए, रोशनी प्रणाली के लिए नमूने के जोखिम समय को कम करना महत्वपूर्ण है। 'प्रतिदीप्ति युग्मित माइक्रोपिपेट आकांक्षा परख' प्रोटोकॉल के संदर्भ में, उत्तेजना प्रकाश स्रोत के प्रतिदीप्ति शटर बंद रहता है जब तक सभी मापदंडों कैमरा ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर के माध्यम से inputted रहे हैं और आकांक्षा प्रणाली प्रयोगों के लिए तैयार है. तभी प्रतिदीप्ति शटर इमेजिंग शुरू करने के लिए चालू है. आगे photobleaching को कम करने के लिए, यह अभी भी नमूने में पर्याप्त प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति पैदावार कि न्यूनतम प्रकाश स्रोत तीव्रता का उपयोग करने की सिफारिश की है.

इसके अलावा, fMPA assays के लिए आवश्यक वर्तमान मैनुअल ऑपरेशन इस तकनीक को श्रम-गहन बनाता है। नतीजतन, इस परख में उत्पन्न होने वाली विसंगतियां मुख्य रूप से ऑपरेटर-निर्भर चर से उत्पन्न हो सकती हैं, साथ ही फिलामेंट प्रीहीटिंग और केशिका ग्लास विशेषताओं में भिन्नता से जुड़े कारक भी हैं। भविष्य में, इस तकनीक के प्रदर्शन का अनुकूलन संभावित अग्रानुक्रम कार्यान्वयन पर विचार करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, जब माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के साथ जोड़ा जाता है, तो माइक्रोपिपेट आकांक्षा को एक उच्च-थ्रूपुट प्लेटफॉर्म में बदल दिया जा सकता है, जो प्रति घंटे लगभग 20 कोशिकाओं का अध्ययन करने से प्रयोगात्मक दर को लगभग 1,000 कोशिकाओं / यह निगमन डेटा की पुनरुत्पादकता में भी सुधार करता है। इसके अलावा, कुछ रास्ते सफलतापूर्वक स्वचालन और छवि विश्लेषण प्रणाली19 को शामिल करके पता लगाया गया है. विशेष रूप से, परिमित तत्व विश्लेषण (एफईए) एक कम्प्यूटेशनल उपकरण है जो आमतौर पर माइक्रोपिपेट आकांक्षा परख को मॉडल करने के लिए नियोजित किया जाता है। एफईए यांत्रिक उत्तेजनाओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी कर सकता है और उनके यांत्रिक गुणों को चिह्नित कर सकता है। यह माइक्रोपिपेट डिजाइन का अनुकूलन करने और आगे प्रयोगात्मक परिणाम19 मान्य करने की क्षमता रखती है.

अंत में, एफएमपीए दृष्टिकोण यांत्रिक उत्तेजनाओं के जवाब में आरबीसी के मेकेनोसेंसिटिव व्यवहारों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। यह अध्ययन आरबीसी के भीतर और व्यापक जैविक प्रणालियों में मैकेनोट्रांसडक्शन के जटिल तंत्र में भविष्य की जांच के लिए एक मूलभूत ढांचा स्थापित करता है। इस तरह की पूछताछ इन तंत्रों की हमारी समझ को आगे बढ़ाने और विभिन्न शारीरिक संदर्भों में उनके व्यापक प्रभावों को उजागर करने के लिए महान वादा करती है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि वर्तमान अध्ययन के बारे में रिपोर्ट करने के लिए उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

हम अतिरिक्त दाता भर्ती, रक्त संग्रह और फ्लेबोटॉमी समर्थन के लिए नुरुल आयशा ज़ैनल अबिदीन और लौरा मोल्दोवन को धन्यवाद देते हैं। हम उपकरण और अभिकर्मकों के आयोजन के लिए टॉमस एंडरसन और एरियन नासर को धन्यवाद देते हैं। इस शोध को ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (एआरसी) डिस्कवरी प्रोजेक्ट (DP200101970-एल) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। ए जे); ऑस्ट्रेलिया आइडियाज ग्रांट (APP2003904-L) की राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC)। ए जे); एनएचएमआरसी उपकरण अनुदान-एलएजे; एनएसडब्ल्यू कार्डियोवास्कुलर क्षमता निर्माण कार्यक्रम (प्रारंभिक-मध्य कैरियर शोधकर्ता अनुदान-एलएजे); एनएसडब्ल्यू सीवीआरएन-वीसीसीआरआई रिसर्च इनोवेशन ग्रांट; ऑफिस ऑफ ग्लोबल एंड रिसर्च एंगेजमेंट (सिडनी-ग्लासगो पार्टनरशिप कोलैबोरेशन अवार्ड-एलएजे); एलएजे एक नेशनल हार्ट फाउंडेशन फ्यूचर लीडर फेलो लेवल 2 (105863), और स्नो मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन फेलो (2022SF176) है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µManager Micro-Manager Version 2.0.0
1 mL Syringe  Terumo 210320D Cooperate with the Microfil 
200 µL Pipette  Eppendorf  3123000055 Red clood cell preparation
22 x 40 mm Cover Slips Knittel Glass  MS0014 Cell chamber assembly
50 mL Syringe  Terumo 220617E Connect to the water tower
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C1016 Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Centrifuge 5425 Eppendorf  5405000280 Red clood cell preparation
Clexane Sigma-Aldrich 1235820 To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL
DAQami Diligent
Fluorescence light source CoolLED pE-300 Micropipette aspiration hardware system
Glass capillary Narishige G-1 Micropipette manufacture
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Hepes Thermo Fisher 15630080 Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
High speed GigE camera Manta G-040B Micropipette aspiration hardware system
High speed pressure clamp Scientific Instrument HSPC-2-SB Cooperate with the pressure pump
High speed pressure clamp head stage  Scientific Instrument HSPC-2-SB Cooperate with the pressure pump
Imaris Oxford Instruments
Inverted Microscopy  Olympus  Olympus IX83 Micropipette aspiration hardware system
Microfil  World Precision Instruments  MF34G-5 34 G (67 mm Long)
Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip 
Micropipette Puller  Sutter instrument P1000 Micropipette manufacture 
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System Merck Millipore ZEQ7000T0C Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation
Pipette microforge  Narishige MF-900 Micropipette manufacture
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Pressue Pump  Scientific Instrument PV-PUMP Induce controlled pressure during experiment
Prime 95B Camera  Photometrics Prime 95B sCMOS Flourscent imaging
Rotary wheel remote unit  Sensapex  uM-RM3 Control panel for micropipette position adjustment 
Scepter 3.0 Handheld Cell Counter Merck Millipore PHCC340KIT Automatic cell counter
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761 Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S2127 Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Sodium Phosphate Monobasic
Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)		 Sigma-Aldrich S9638 Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Touch screen control unit  Sensapex  uM-TSC Control panel for micropipette position adjustment 
X dry Objective  Olympus  Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL Micropipette aspiration hardware system

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References

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जीवविज्ञान अंक 203 मेकेनोबायोलॉजी माइक्रोपिपेट आकांक्षा कैल्शियम लाल रक्त कोशिका मैकेनोसेंसिटिव आयन चैनल
प्रतिदीप्ति माइक्रोपिपेट आकांक्षा परख लाल रक्त कोशिका mechanosensing की जांच करने के लिए
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