Summary
Mekanik stres altında hücresel davranışın araştırılması, hücresel mekanik ve mekanobiyolojideki ilerlemeler için çok önemlidir. Kontrollü mekanik stimülasyonu tek hücrelerde hücre içi sinyallemenin kapsamlı analizi ile birleştiren yeni bir yöntem olan Floresan Mikropipet Aspirasyonu (fMPA) tekniğini sunuyoruz. Bu teknik, canlı hücre mekanobiyolojisinin yeni derinlemesine çalışmalarını araştırır.
Abstract
Mikropipet aspirasyon testleri, canlı hücre mekaniğinin araştırılması için uzun süredir bir mihenk taşı olmuştur ve mekanik strese hücresel tepkiler hakkında içgörüler sunmaktadır. Bu makale, floresan bağlantılı mikropipet aspirasyonu (fMPA) testinin yenilikçi bir uyarlamasını detaylandırmaktadır. fMPA testi, iyon kanallarının aracılık ettiği canlı hücre mekanotransdüksiyon süreçlerini eşzamanlı olarak izlerken hassas mekanik kuvvetleri yönetme yeteneğini sunar. Gelişmiş kurulum, hassas bir şekilde düzenlenmiş bir su haznesine ve pnömatik aspirasyon sistemine bağlı, hassas bir şekilde tasarlanmış bir borosilikat cam mikropipet içerir ve 1 mmHg'± kadar rafine artışlarla kontrollü basınç uygulamasını kolaylaştırır. Önemli bir gelişme, aspirasyon sırasında hücre morfolojik değişikliklerinin ve hücre içi kalsiyum akışlarının eşzamanlı olarak gözlemlenmesine ve ölçülmesine izin veren epi-floresan görüntülemenin entegrasyonudur. fMPA testi, epi-floresan görüntülemenin mikropipet aspirasyonu ile sinerjik kombinasyonu sayesinde, mekanik olarak zorlu ortamlarda hücre mekanizasyonu çalışması için yeni bir standart belirliyor. Bu çok yönlü yaklaşım, çeşitli deney düzeneklerine uyarlanabilir ve tek hücreli mekanoalgılama mekanizmalarına ilişkin kritik bilgiler sağlar.
Introduction
Hücresel davranışlar dünyasında ortaya çıkan keşifler, yapışma, göç ve farklılaşma gibi dinamik hücresel aktiviteleri dikte etmede gerilim, sıvı kesme gerilimi, sıkıştırma ve substrat sertliği gibi mekanik uyaranların rolünü vurgulamıştır. Bu mekanobiyolojik yönler, hücrelerin fizyolojik çevreleriyle nasıl etkileşime girdiğini ve bunlara nasıl tepki verdiğini aydınlatmada büyük önem taşır ve çeşitli biyolojik süreçleri etkiler 1,2.
Son on yılda, mikropipet bazlı aspirasyon testleri, mekanik uyaranlara verilen çeşitli hücresel tepkilerin incelenmesinde çok yönlü bir araç olarak öne çıkmıştır. Bu teknik, hücresel elastik modül, sertlik ve kortikal gerginlik dahil olmak üzere tek hücre düzeyinde canlı hücrelerin içsel mekanik özellikleri hakkında değerli bilgiler sunar. Bu tahliller, hücre zarı gerginliği, hücre zarına uygulanan basınç ve kortikal gerginlik gibi çeşitli mekanik parametrelerin ölçülmesini sağlar (Tablo 1'de özetlenmiştir). İlham verici kuvvetleri incelemek, özellikle parçalanma, uzama ve tomurcuklanmadahil olmak üzere zar dinamiği alanında, hücresel işlevleri ve süreçleri nasıl etkilediklerine dair anlayışımızı zenginleştirmiştir 3,4.
| Mekanik Parametre | Tarif | Ufuk açıcı yaklaşımlar |
| Hücre Sertliği | Bir hücrenin mekanik sertliğinin ve elastikiyetinin ölçülmesi. | Hücre zarının aspirasyonu ve negatif basınca deformasyon tepkisinin analizi20,21. |
| Yapışma Dayanımı | Hücrelerin yüzeylere ne kadar güçlü yapıştığının değerlendirilmesi. | Yapışan hücreleri bir substrattan ayırmak için kontrollü emme uygulaması2,22. |
| Membran Gerginliği | Hücre zarlarındaki gerginlik veya stresin değerlendirilmesi. | Uygulanan basınca tepki olarak membran deformasyonunun ölçülmesi23,24. |
| Viskoelastik Özellikler | Bir hücrenin birleşik viskoz ve elastik davranışının karakterizasyonu. | Aspirasyona zamana bağlı deformasyon yanıtının analizi23,25. |
| Deforme olabilirlik | Bir hücrenin şeklini ne kadar kolay değiştirebileceğinin belirlenmesi. | Kontrollü emiş altında deformasyon derecesinin değerlendirilmesi20,24. |
| Yüzey gerilimi | Hücre yüzeyindeki gerilimin ölçülmesi. | Mikropipet membran çıkıntısı oluşturmak için gereken basıncın değerlendirilmesi26. |
| Hücre-Malzeme Etkileşimi | Hücreler ve malzemeler veya substratlar arasındaki etkileşimlerin incelenmesi. | Farklı maddelerle temas eden hücrelerin aspirasyonu ve etkileşimlerinin gözlenmesi2,24. |
| Hücre-Hücre Etkileşimi | Komşu hücreler arasındaki etkileşimlerin incelenmesi. | Bir grup hücrenin aspirasyonu ve hücreler arası kuvvetlerinin analizi27. |
Tablo 1: Mikropipet aspirasyon testi ile karakterize edilen mekanik parametreler.
Mikropipet bazlı aspirasyon tekniği, dolaşım sistemindeki işlevlerini anlamak için gerekli olan eritrositlerin deforme olabilirliğini ve çeşitli mekanik özelliklerini değerlendiren kırmızı kan hücrelerini (RBC'ler) incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. RBC'ler, karmaşık kılcal ağ ve endotelyal yarıklararasında gezinirken deformasyona karşı mekanik çok yönlülüklerini koruyarak dikkate değer bir uyarlanabilirlik sergilerler 5,6. Bu yolculuk sırasında, RBC'ler 0.5-1.0 μm kadar dar geçitlerden geçmeli ve kendilerini gerilim ve sıkıştırma 7,8,9 dahil olmak üzere çok sayıda mekanik kuvvete maruz bırakmalıdır. Ayrıca dolaşım sırasında kan akışının oluşturduğu kayma gerilimine karşı yüksek hassasiyete sahiptirler10. Bu süreçler, mekanik uyaranlara hücresel tepkilerde köklü rolleri olan çok önemli bir sinyal olayı olan kalsiyum akışını içeren düzenleyici mekanizmaların aktivasyonunu teşvik eder 11,12. Kalsiyum aracılı mekanosalgılamayı yöneten karmaşık mekanizmalar, devam eden araştırmaların zorlayıcı konuları olmaya devam etmektedir.
Bu bağlamda, fMPA, mekanik modülasyonun (mikropipet aspirasyon sistemi kullanılarak) eşzamanlı olarak uygulanmasına ve kalsiyum yoğunluğunun görselleştirilmesine (floresan göstergeler kullanılarak) izin vererek, hassas bir şekilde kontrol edilen mekanik kuvvetler altında kalsiyum mobilizasyonunun kapsamını ortaya çıkarmak için etkili bir yaklaşım olarak durmaktadır. Özellikle RBC daralan kan damarlarından geçerken fizyolojik senaryoyu taklit eder. Geliştirdiğimiz fMPA sisteminin 1 mmHg çözünürlükte basınç üretebildiğini belirtmekte fayda var. Uygulanan yüksek hızlı kamera, 100 ms'lik bir zamansal çözünürlüğe ve mikron altı düzeyde uzamsal bir çözünürlüğe ulaşabilir. Bu konfigürasyonlar, mekanik kuvvetlerin canlı hücrelere hassas bir şekilde uygulanmasını sağlar ve aynı anda ortaya çıkan hücresel sinyali yakalar. Ayrıca, bu kurulumun bütünleştirici mühendislik doğası nedeniyle, mikropipet aspirasyon testi, diğer ekipman veya teknikleri tamamlayacak şekilde kolayca uyarlanabilir ve hücre mekaniğinin karmaşıklıklarının daha fazla araştırılmasını sağlar. Bu çok yönlülük, bu yaklaşımın ek bir avantajı olarak durmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Sidney Üniversitesi İnsan Araştırmaları Etik Komitesi'nin yönergelerini takip eder ve bu komite tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için donörlerden bilgilendirilmiş onam alındı.
1. İnsan RBC izolasyonu
NOT: Adım 1.1, Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmış bir protokol kullanılarak eğitimli bir flebotomist tarafından gerçekleştirilmelidir.
- 19 G kelebek iğnesi kullanarak medyan kübital damardan 5 mL kan çekin.
- Pıhtılaşmayı önlemek için toplanan kanı 1:200 enoksaparin içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- 5 μL enoksaparin-antikoagüle kanı 1 mL karbonat/bikarbonat tamponunda seyreltin (C-tamponu, pH = 8.5-9; Malzeme Tablosu).
- Seyreltilmiş kan örneğini eritrositleri çökeltmek için 900 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- RBC peletini 1 mL C-tamponu (Malzeme Tablosu) ile iki kez yıkayın ve her seferinde 1 dakika boyunca 900 × g'da santrifüjleyin.
- Daha sonra, aynı santrifüjleme koşullarını kullanarak RBC peletini 2x 1 mL Tyrode tamponu ile yıkayın ve ardından yıkanmış stok RBC süspansiyonunu elde etmek için son peleti 1 mL Tyrode tamponunda yeniden süspanse edin.
2. Kalsiyum indikatörü yükleme
- Otomatik hücre sayacı kullanılarak elde edilen hücre sayısına bağlı olarak, yıkanmış stok RBC çözeltisinin konsantrasyonunu Tyrode tamponunda 10 × 106 hücre/mL'ye ayarlayın (Malzeme Tablosu).
- Kalsiyuma duyarlı bir boya olan 16.67 μM Cal-520 ile inkübe ederek ve döner tüplü karıştırıcıda 1 saat çalkalayarak RBC'lerin içindeki kalsiyumu etiketleyin.
- RBC'leri Tyrode'un tamponunda% 0.5 sığır serum albümini (BSA) içeren 1:50 oranında seyreltin. Hücreler artık deneysel kullanıma hazırdır.
3. Mikropipet üretimi
- Borosilikat cam kılcal boruyu (1 mm dış çap x 0.6 mm iç çap) P-1000 mikropipet çektirmesine monte edin ve önceden ayarlanmış çekme programını kullanarak çekme yerinde kapalı uçlu iki karşılık gelen mikropipet üretin. Bu kurulum için aşağıdaki çekme programı değerlerini kullanın: ısı 516, çekme 150, hız 75, zaman 250 ve basınç 500.
NOT: Çekme programında ayarlanan ısıtma ve çekme parametreleri özelleştirilebilir ve deney tasarımının12 istenen ayarlarına bağlıdır. KONTROL NOKTASI (Ek Tablo S1'e bakın). - Mikropipet kesiciye çektikten sonra temin edilen kapalı uçlu mikropipetlerden birini takarak kapalı ucu açın. Isıtma sıcaklığını yaklaşık 50-60 °C'ye ayarlayın.
- 10x göz merceği kullanarak mikropipeti bulun. Ayar düğmelerini kullanarak mikropipeti borosilikat cam boncuğa yaklaştırın.
- Mikropipeti pipet ucunu bükmeden borosilikat cam boncuğa mümkün olduğunca yakın yerleştirmeden önce göz merceğini 30x olarak değiştirin.
- Isıtma pedalına basarak borosilikat cam boncuğu ısı kullanarak yumuşatın. Çiğ kapalı mikropipet ucunu, istenen son noktaya, açıklık çapına ulaşılana kadar yumuşatılmış boncuğa yavaşça sokun.
- Ayak pedalını bırakın ve cam boncuğun soğumasını bekleyin. Mikropipetin ucunun her zaman boncuğun içinde kaldığından emin olun.
NOT: Ucun daha fazla sokulması, daha büyük açıklık çaplarına yol açar. - Mikropipeti nazikçe çıkarın, böylece kapalı mikropipet üzerinde net ve düz bir kesim elde edin. Kılcal damarın son çapının 1 μm olduğunu onaylayın.
NOT: KONTROL NOKTASI (Ek Tablo S1'e bakın)
4. Hücre odası hazırlığı
- Standart 40 mm x 22 mm x 0,17 mm cam lamel üç eşit şeride bölmek için elmas kalem kullanın.
- Kesilmiş cam lamellerin bir parçasını ev yapımı bir hazne tutucunun altına vakumlu gres ile yapıştırın.
NOT: Hazne tutucu, kavisli bir tutamakla birbirine bağlanan iki metal (bakır/alüminyum) kareden oluşur. Kesilen lamellerin paralel bir oda oluşturacak şekilde tutucuya yapışması için metal bloklar arasındaki mesafe 40 mm'den az olmalıdır. - Kesilmiş cam lamellerin ikinci parçasını ev yapımı hazne tutucunun üstüne vakumlu gres ile yapıştırın.
NOT: KONTROL NOKTASI (Ek Tablo S1'e bakın) - 200 μL'lik bir pipet tabancası kullanarak iki lamel arasına 200 μL etiketli RBC süspansiyonu enjekte edin (Şekil 1).
Şekil 1: Hücre odasının çizimi. 40 mm x 22 mm x 0,17 mm boyutlarında bir cam kapak astarının iki kesilmiş parçası, gres kullanılarak hazne tutucuya yapıştırılır. İki kesilmiş cam lamel arasında, Tyrode Tamponundaki hücre çözeltisinin yaklaşık 200 μL'si ekilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
5. Mikropipet aspirasyon tertibatı
- Hücre odasını mikroskop platformunda bulunan tutucu tablaya monte edin. Konumu, hücre odası doğrudan hedefin üzerinde olacak şekilde ayarlayın (Şekil 2B).
- Mikropipet tutucuyu, bağlı su haznesinin sıvı seviyesinin altına indirin.
- Fabrikasyon mikropipete demineralize su veya Tyrode tamponu enjekte edin ve 34 G'lik bir iğne ile birleştirilmiş bir şırınga kullanarak tüm hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarın (bkz.
- Mikropipet tutucunun ucunu yarıya kadar sökün ve suyun mikropipet tutucudan birkaç saniye damlamasına izin verin.
NOT: KONTROL NOKTASI (Ek Tablo S1'e bakın) - Mikropipeti tutucu ucuna yerleştirin. Mikropipetin sabitlendiğinden emin olmak için tutucu vidayı sıkın.
- Mikropipeti hücre odasına yerleştirin ve mikropipeti ve RBC'leri mikroskop altında bulun. Konumu ayarlamak için mikromanipülatörü kullanın.
- Ucun bulunan RBC ile aynı hizada olduğundan emin olmak için mikropipet ucunu daha da indirin.
NOT: KONTROL NOKTASI (Ek Tablo S1'e bakın) - Su haznesinin yüksekliğini ayarlayarak mikropipet ucundaki hidrolik basıncı sıfırlayın. Ardından, uçta ince bir pozitif basınç oluşturmak için su haznesini hafifçe kaldırın.
6. Floresan bağlantılı mikropipet aspirasyon testini gerçekleştirin
- 488 nm floresan uyarma ışık kaynağını açın. Foto ağartmayı önlemek için bu aşamada floresan deklanşörü açmayın (Şekil 2C). Floresan kamerayı ve iletilen kamerayı açın.
NOT: Her iki kamera da uygun yazılım kullanılarak çalıştırılır (bkz. Malzeme Tablosu). - Yazılımda her iki kamera için istenen pozlama süresini (bu çalışmada her iki kamera için 100 ms), ilgilenilen bölgeyi (ROI), gruplama boyutunu (bu çalışma için yok) ayarlayın. Alım çerçeve numarasını, bu etüt için 2.000'i ve kaydetme dizinini ayarlamak için çok boyutlu alım panelini açın.
NOT: Alma çerçeve numarası, kaydedilecek istenen aspirasyon olayı sayısına bağlıdır. 1 aspirasyon olayı için, alım sayısının aralığı 100-500 arasında ayarlanmalıdır, bu da yaklaşık 10-50 s'dir. - Mikromanipülatörü kullanarak görüş alanı altındaki mikropipeti bulun.
- Pnömatik basıncı açınamp, kontrol kutusu ve cl dahilamp sistem (Şekil 2A). Kontrol kutusunun EXTRNL modunda olduğundan emin olun. Düğmeyi yavaşça çevirerek sistem içindeki herhangi bir ofset basıncını telafi edin.
- Pnömatik kelepçeyi kontrol eden ayrı yazılımı açın. Yazılım, kelepçe sistemine ayrık analog girişi kontrol etmek için bir elektrik kontrol paneline sahiptir. Basınç, 20 mV/mmHg dönüşüm faktörü ile kontrol edilir.
- Sistem içindeki basıncı sıfırlayın. Mikropipeti dikkatli bir şekilde RBC'lerin yakınına yerleştirin. Mikropipet ucunda hafif bir pozitif basınç fark edilene kadar su haznesi konumunu ayarlayın.
- Kamerayı çalıştırma yazılımında satın alma işlemini başlatın. Floresan deklanşörü açın.
- İstenilen basınca ulaşmak için hesaplanan voltaj büyüklüğünü kontrol paneline yazarak bir RBC'yi aspire edin.
NOT: Bir RBC'yi aspire etme basıncı tipik olarak Δp = -5 ila -40 mmHg aralığındadır. Mikropipet ucunda gözle görülür bir dil uzaması olmalıdır (Şekil 2D). - Basıncı önceden ayarlanmış bir süre tutun; Ardından, basıncı serbest bırakın.
- Bir sonraki hücreyi almak için mikropipeti hareket ettirin ve deneyi tekrarlayın.
7. Floresan yoğunluk analizi
- Kaydedilen floresan görüntülerini analiz yazılımına yükleyin.
- Ekran ayar sekmesini kullanarak yoğunluk eşiğini ayarlayın. Bunu, değerleri manuel olarak girerek veya floresan görüntülerin analiz yazılımında hücrenin net bir kontrastını göstermesini sağlamak için kaydırıcıyı kullanarak yapın (bkz. Ek Dosya 1-Ek Şekil S1).
- Yazılımın altındaki zaman çizelgesine gidin. Belirlenen aspirasyon olayını bulun.
- Yeni yüzeyler ekle'yi tıklayın. Analiz yatırım getirisini tanımlayın.
NOT: Yazılım, segmentasyonu ayarlamak ve tamamlamak için kılavuzlu beş adımlı bir süreç sağlar (bkz. Ek Dosya 1-Ek Şekil S2 ve Ek Şekil S3).
NOT: Hesaplama kaynaklarından tasarruf etmek için yatırım getirisini mümkün olduğunca küçük tutun. - En iyi segmentasyon sonucunu elde etmek için arka plan çıkarma kaydırıcısını kullanın ve kaydırıcıyı kullanarak segmentasyon eşiğini ayarlayın.
NOT: Bu, aspirasyon olayından ayrı olarak, arka planın mümkün olduğunca doğru bir şekilde bölümlere ayrılması gerektiği anlamına gelir (bkz. Ek Dosya 1-Ek Şekil S4 ve Ek Şekil S5). - Arka plan gürültülerini dışlamak için bir alan filtresi ekleyin (bkz. Ek Dosya 1-Ek Şekil S6).
NOT: Bu, işlem sonrası aşamada tamamlanır. - İstatistikler sekmesini seçin | Ayrıntılı Sekme | Ortalama değerler sekmesi. Yoğunluk ortalamasını bulmak ve seçmek için kaydırın (bkz. Ek Dosya 1-Ek Şekil S7).
- Zaman içindeki floresan sinyal izini bir .csv dosyasına aktarın.
- Dışa aktarılan csv dosyasını açın. Arka plan sinyallerini ( Fb) tüm ölçümlerden çıkarın.
- Denklem (1)'i kullanarak kalsiyum yoğunluğu değişimini (ΔFmax) hesaplayın:
(1)
ΔFmax maksimum kalsiyum yoğunluğu değişimi, Fb arka plan yoğunluğu ve F0 dinlenme yoğunluğudur.
(1)
Şekil 2: Floresan bağlantılı mikropipet aspirasyon tertibatı. (A) Parlak alan ve floresan kameralarla birlikte ters çevrilmiş mikroskobu içeren fMPA donanım sistemine genel bakış. Resmin sol tarafı, ev yapımı su manometresini ve pnömatik basınç pompasının basıncını hassas bir şekilde ayarlamaya izin veren kontrol kutusunu göstermektedir. (B) Tek bir mikropipet ile deney hücresi odasını ve mikromanipülatör sistemini gösteren mikroskop aşaması. (C) fMPA sistem kurulumunun şeması. Parlak alan (sarı) ve floresan (mavi emisyon, yeşil uyarma) sinyallerinin, ışık yollarını floresan ışık kaynağından (mavi) hedefe, ardından görüntüleme için kameralara (yeşil) yönlendirmek için iki dikroik ayna kullanarak eşzamanlı görüntülemesi. (D) Üst sıra parlak alan görüntülerini, alt sıra ise floresan görüntüleri gösterir. Sol, RBC hareketsizken mikropipetin aspirasyondan önceki konumunu temsil eder. Orta sütun, RBC'nin -40 mmHg'lik bir negatif basınca maruz kaldığı aspirasyon sürecini anlık olarak gösterir. Sağ, negatif aspirasyon basıncını deneyimledikten sonra hücre morfolojisini gösterir. Ölçek çubuğu = 5 μm. Kısaltmalar: fMPA = Floresan bağlantılı Mikropipet Aspirasyonu; DM = dikroik ayna; RBC = kırmızı kan hücresi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikropipet aspirasyon tahlilleri oluşturmak için önce bir sapla birbirine bağlanmış iki metal kareden (bakır/alüminyum) oluşan özel bir hücre odası oluşturduk. Tyrode'un Tamponunda asılı duran 200 μL RBC ile dolu bir oda oluşturmak için iki adet üçüncü kesim cam lamel (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) yapıştırıldı. RBC'leri hazneye soktuktan sonra, özel bir borosilikat mikropipet bir tutucuya sabitlendi ve bir mikro manipülatör kullanılarak hazne içine dikkatlice yerleştirildi. Daha sonra, hedef RBC'yi yakalamak için mikropipet yaklaştırıldı.
Hücre aspirasyonu için yöntem, negatif aspirasyon basıncına ince ayar yapmak için pnömatik yüksek hızlı bir basınç kelepçesi kullandı. Daha sonra uygulanan farklı negatif aspirasyon basınçlarında kalsiyum mobilizasyonunu araştırmak için floresan görüntüleme yapıldı.
RBC'lerin değişen negatif aspirasyon basınçlarına nasıl tepki verdiğini araştırmak için fMPA'yı kullanarak, bulgularımız, uygulanan negatif basınç ile aspire edilen RBC'de bulunan kalsiyum akışı arasında açık bir orantılı ilişki olduğunu ortaya koymaktadır. Kalsiyum yoğunluğu değişimini belirlemek için, tek aspire edilen hücrenin maksimum yoğunluğu (Fmaks) eksi arka plan yoğunluğu (Fb) dinlenme yoğunluğuna (F0) eksi Fb'ye bölünmüştür. Basınç kademeli olarak -10 mmHg (Şekil 3A) ila -40 mmHg (Şekil 3D) arasında arttırıldığında, kalsiyum iyonlarının RBC'lere akışında karşılık gelen bir artış olmuştur. Bu, RBC'lerin mekanik değişikliklerini algılama ve hızlı kalsiyuma özgü kanal aktiviteleri ile yanıt verme yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir14,15.
Şekil 3: Zamana karşı normalleştirilmiş yoğunluk değişikliklerinin grafiksel gösterimi ile floresan görüntüleme. Yatay olarak, durağan RBC'lerin floresan anlık görüntülerini (solda) ve mikropipet tarafından aspire edilen insan RBC'lerini (ortada) gösterir. Birden fazla negatif aspirasyon basıncında (Δp) aspire edilen RBC'lerin temsili izleri sağda görülebilir. Negatif aspirasyon basıncı, (A) Δp = -10 mmHg, (B) Δp = -20 mmHg, (C) Δp = -30 mmHg ve (D) Δp = -40 mmHg'den başlayarak kademeli olarak artırılır. Aspirasyon sırasında RBC'nin dili uzadığında, artmış Cal-520 kat değişikliği ile gösterildiği gibi önemli bir kalsiyum mobilizasyonu gözlemlenebilir. Aspire edilen RBC içindeki kalsiyum mobilizasyonunu araştırmak için F/F0 kullanıldı. Yukarıdaki eğrilerden, gözlemlenen eğilim, Cal-520 sinyalinin, uygulanan negatif aspirasyon basıncının artmasıyla orantılı olarak arttığını göstermiştir. Ölçek çubuğu = 5 μm. Kısaltma: RBC'ler = kırmızı kan hücresi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo S1: fMPA hazırlık protokollerindeki kritik adımlar için kontrol noktaları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Segmentasyonu ayarlamak ve gerçekleştirmek için kılavuzlu bir işlem. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikropipet aspirasyon deneyleri, hücresel biyomekaniğin derin karmaşıklıklarını araştırmak için önemli basınç modülasyonu, tam uzamsal orkestrasyon ve güvenilir zamansal ayırt etme uygulayan rafine bir metodolojiyi somutlaştırır. Bu çalışma, RBC'ler tarafından değişen uyaranlar altında sergilenen nüanslı mekanosensitif tepkileri ortaya çıkarmak için çok önemli bir araç olarak fMPA'nın uygulanmasına özel bir vurgu yapmaktadır. Parlak alan ve floresan sinyallerinin eşzamanlı kullanımı, hücresel olayların çok yönlü bir şekilde araştırılmasını sağlayarak, hücre içi kalsiyum akışının gerçek zamanlı olarak izlenmesini ve tespit edilmesini ilerletti. Bu yaklaşım, RBC'lerin karmaşık mekanoalgılama reaksiyonlarına bütünleştirici bir bakış açısı sağlar.
Daha da önemlisi, fMPA tekniğinin uygulanabilirliği, trombositler ve nöronlar gibi yüksek mekanik hassasiyet uygulayamayan diğer hücre tipleriyle birlikte kullanılabildiğinden, RBC'lerin ötesine uzanır9. Ayrıca, deneysel kullanım sırasında hücre bütünlüğü üzerindeki minimum etkisi nedeniyle, fMPA, hücrenin doğal durumunun korunmasını garanti eder ve bu da onu birincil hücrelerle kullanım için son derece uygun hale getirir1. Ayrıca, fMPA yöntemi, mikropipetlerin ayarlanabilir geometrisi sayesinde çok yönlülük sunarak, belirli araştırma sorularına göre uyarlanmış daha geniş bir deneysel tasarım yelpazesine ve çeşitli mekanik koşulların etkili bir şekilde araştırılmasına olanak tanır.
Ek olarak, çoklu floresan görüntülemenin eşzamanlı kullanımını artıran optik yoldaki iyileşme ile fMPA sistemi, aspirasyon sırasında hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun gerçek zamanlı olarak tespit edilmesini sağlar. Bu yetenek, dış ortamlardan gelen mekanik ipuçlarına aracılık ettiği ve algıladığı gösterilen mekanosensitif iyon kanalı PIEZO1 gibi kalsiyumla ilgili molekülleri keşfetme fırsatı sunar 7,14. Son literatür, PIEZO1 kanal aktivitesini uyaran ve ardındanCa2+ akışını kolaylaştıran önemli bir faktör olarak membran gerginliğindeki bir artışı vurgulamaktadır6. Bu, membran gerilimi, PIEZO1 ve kalsiyum akışı arasındaki etkileşimi araştırmak ve hücrelerdeki karmaşık mekanoalgılama süreçlerine ışık tutmak olan fMPA'nın çok önemli bir uygulamasının altını çiziyor.
Teknik açıdan bakıldığında, aspirasyon kuvvetini (mekanik uyaranlar) oluşturmaktan ve gerçek zamanlı floresan görüntüleme yapmaktan sorumlu olan fMPA sisteminin iki ana bileşeninin sırasıyla pnömatik basınç pompası ve floresan kamera olduğunu belirtmekte fayda var. Sistem için uygun pompa ve kameranın seçimi, incelenen spesifik hücre tipine ve biyolojik sürece dayanmalıdır. Sistemimizde kullanılan pompa, 200 mmHg'± sabit durum basınç aralığında çalışır ve 200 mmHg'± kadar önemli basınç değişiklikleri için komutlara yanıt verebilir. Basınç yükselme süresi ve düşme süresi 6 mmHg'lik bir adım için 8-20-20 ms'yi ve 15 mmHg'lik bir adım için 20-200 ms'yi geçmemelidir. Kuvvet çözünürlüğünü sağlamak için, HSPC sisteminin gürültü seviyesi tepeden tepeye ± 0,5 mmHg'den az olmalıdır. Bu gereksinimler bu kurulumda uygulanır; bununla birlikte, deneysel protokol15 için bir yanıt elde etmek için 40 mmHg'± bir aralık yeterlidir. Floresan kamera ile ilgili olarak, %95 Kuantum Verimliliği ve 11 μm x 11 μm piksel boyutunda bir çip seçtik. Bu hassas sensör konfigürasyonu, floresan sinyalini yüksek hızda verimli bir şekilde yakalar. Ek olarak, görüntüleme sırasında yeterli bir sinyal-gürültü oranı için medyan okuma gürültüsünün1,6 e- olması çok önemlidir 16.
Prosedürel bir bakış açısıyla, fMPA'yı yürütmek bir dizi gelişmiş beceri gerektirir. Örneğin, mikropipet kesiciyi kullanarak mikropipet üretmek, hassasiyet ve el becerisinin yanı sıra sıcaklık ve konumlandırmanın titiz bir şekilde kontrol edilmesini gerektirir. Mikropipeti mikroskobun görüş alanı içine yerleştirmek, hem mikropipet ucuna hem de hücresel hazneye zarar vermemek için titiz bir çaba gerektirir. Ek olarak, floresan görüntüleme ile ilgili yaygın bir zorluk, foto ağartmadır. Bu sorunu azaltmak için, numunenin aydınlatma sistemine maruz kalma süresini en aza indirmek önemlidir. 'Floresan bağlantılı mikropipet aspirasyon testi' protokolüne göre, uyarma ışık kaynağının floresan deklanşörü, tüm parametreler kamera işletim yazılımı aracılığıyla girilene ve aspirasyon sistemi deneyler için hazır olana kadar kapalı kalır. Ancak o zaman görüntülemeyi başlatmak için floresan deklanşör açılır. Foto ağartmayı daha da azaltmak için, numunede hala yeterli floresan ekspresyonu sağlayan minimum ışık kaynağı yoğunluğunun kullanılması önerilir.
Ayrıca, fMPA tahlilleri için gerekli olan mevcut manuel işlem, bu tekniği emek yoğun hale getirir. Sonuç olarak, bu tahlilde ortaya çıkabilecek tutarsızlıklar, öncelikle operatöre bağlı değişkenlerin yanı sıra filament ön ısıtma ve kılcal cam özelliklerindeki değişikliklerle ilişkili faktörlerden kaynaklanmaktadır. Gelecekte, bu tekniğin performansını optimize etmek, potansiyel tandem uygulamalarının dikkate alınmasını gerektirmektedir. Örneğin, mikroakışkan cihazlarla birleştirildiğinde, mikropipet aspirasyonu yüksek verimli bir platforma dönüştürülebilir ve bu da deney oranını saatte yaklaşık 20 hücreden yaklaşık 1.000 hücre/saate önemli ölçüde artırır17,18. Bu birleştirme aynı zamanda verilerin tekrarlanabilirliğini de artırır. Ayrıca, otomasyon ve görüntü analiz sistemleri dahil edilerek belirli yollar başarılı bir şekilde araştırılmıştır19. Özellikle, sonlu elemanlar analizi (FEA), mikropipet aspirasyon testlerini modellemek için yaygın olarak kullanılan bir hesaplama aracıdır. FEA, mekanik uyaranlara hücresel yanıtı tahmin edebilir ve mekanik özelliklerini karakterize edebilir. Mikropipet tasarımını optimize etme ve deneysel sonuçları daha da doğrulama potansiyeline sahiptir19.
Sonuç olarak, fMPA yaklaşımı, RBC'lerin mekanik uyaranlara yanıt vermedeki mekanosensitif davranışları hakkında değerli bilgiler sunmaktadır. Bu çalışma, RBC'ler içinde ve daha geniş biyolojik sistemlerde mekanotransdüksiyonun karmaşık mekanizmalarına ilişkin gelecekteki araştırmalar için temel bir çerçeve oluşturmaktadır. Bu tür araştırmalar, bu mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı ilerletmek ve çeşitli fizyolojik bağlamlardaki kapsamlı etkilerini çözmek için büyük umut vaat ediyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu çalışma ile ilgili olarak rapor vermek için herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Nurul Aisha Zainal Abidin ve Laura Moldovan'a ek donör alımı, kan alma ve flebotomi desteği için teşekkür ederiz. Ekipman ve reaktifleri organize ettikleri için Tomas Anderson ve Arian Nasser'e teşekkür ederiz. Bu araştırma, Avustralya Araştırma Konseyi (ARC) Keşif Projesi (DP200101970-L. A.J.); Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) Fikirler Hibesi (APP2003904-L. A.J.); NHMRC Ekipman Hibesi-LAJ; NSW Kardiyovasküler Kapasite Geliştirme Programı (Erken-Orta Kariyer Araştırmacısı Hibesi-LAJ); NSW CVRN-VCCRI Araştırma İnovasyon Hibesi; Küresel ve Araştırma Katılımı Ofisi (Sidney-Glasgow Ortaklık İşbirliği Ödülü-L.A.J.); LAJ, Ulusal Kalp Vakfı Gelecek Lideri Üyesi Seviye 2 (105863) ve Kar Tıbbi Araştırma Vakfı Üyesidir (2022SF176).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µManager | Micro-Manager | Version 2.0.0 | |
| 1 mL Syringe | Terumo | 210320D | Cooperate with the Microfil |
| 200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | Red clood cell preparation |
| 22 x 40 mm Cover Slips | Knittel Glass | MS0014 | Cell chamber assembly |
| 50 mL Syringe | Terumo | 220617E | Connect to the water tower |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000280 | Red clood cell preparation |
| Clexane | Sigma-Aldrich | 1235820 | To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL |
| DAQami | Diligent | ||
| Fluorescence light source | CoolLED | pE-300 | Micropipette aspiration hardware system |
| Glass capillary | Narishige | G-1 | Micropipette manufacture |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Hepes | Thermo Fisher | 15630080 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| High speed GigE camera | Manta | G-040B | Micropipette aspiration hardware system |
| High speed pressure clamp | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
| High speed pressure clamp head stage | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
| Imaris | Oxford Instruments | ||
| Inverted Microscopy | Olympus | Olympus IX83 | Micropipette aspiration hardware system |
| Microfil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip |
| Micropipette Puller | Sutter instrument | P1000 | Micropipette manufacture |
| Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System | Merck Millipore | ZEQ7000T0C | Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation |
| Pipette microforge | Narishige | MF-900 | Micropipette manufacture |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Pressue Pump | Scientific Instrument | PV-PUMP | Induce controlled pressure during experiment |
| Prime 95B Camera | Photometrics | Prime 95B sCMOS | Flourscent imaging |
| Rotary wheel remote unit | Sensapex | uM-RM3 | Control panel for micropipette position adjustment |
| Scepter 3.0 Handheld Cell Counter | Merck Millipore | PHCC340KIT | Automatic cell counter |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) |
Sigma-Aldrich | S9638 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Touch screen control unit | Sensapex | uM-TSC | Control panel for micropipette position adjustment |
| X dry Objective | Olympus | Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL | Micropipette aspiration hardware system |
References
- González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).
- Mierke, C. T. Physics of Cancer, Volume 3 (Second Edition): Experimental biophysical techniques in cancer research. , IOP Publishing. (2021).
- Chen, Y., et al. Loss of the F-BAR protein CIP4 reduces platelet production by impairing membrane-cytoskeleton remodeling. Blood. 122 (10), 1695-1706 (2013).
- Shin, J. -W., Swift, J., Spinler, K. R., Discher, D. E. Myosin-II inhibition and soft 2D matrix maximize multinucleation and cellular projections typical of platelet-producing megakaryocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11458-11463 (2011).
- Liapis, H., Foster, K., Miner, J. H. Red cell traverse through thin glomerular basement membrane. Kidney International. 61 (2), 762-763 (2002).
- Wang, H., et al. Fluorescence-coupled micropipette aspiration assay to examine calcium mobilization caused by red blood cell mechanosensing. European Biophysics Journal. 51 (2), 135-146 (2022).
- Danielczok, J. G., et al. Red blood cell passage of small capillaries is associated with transient Ca2+-mediated adaptations. Frontiers in Physiology. 8, 979 (2017).
- Diez-Silva, M., Dao, M., Han, J., Lim, C. -T., Suresh, S. Shape and biomechanical characteristics of human red blood cells in health and disease. MRS Bulletin. 35 (5), 382-388 (2010).
- Maître, J. -L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. eLife. 5, e15447 (2016).
- Bogdanova, A., Makhro, A., Wang, J., Lipp, P., Kaestner, L. Calcium in red blood cells-a perilous balance. International Journal of Molecular Sciences. 14 (5), 9848-9872 (2013).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018. , Available from: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf (2018).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Sforna, L., et al. Piezo1 controls cell volume and migration by modulating swelling-activated chloride current through Ca2+ influx. Journal of Cellular Physiology. 237 (3), 1857-1870 (2022).
- High speed pressure clamp. ALA Scientific Instruments. , ALA Scientific. Available from: https://alascience.com/products/hspc-2sb/ (2023).
- Teledyne Imaging Prime 95BTM Scientific CMOS Camera Datasheet. , Available from: https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2019/10/Prime-95B-Datasheet-07172020.pdf (2020).
- Lee, L. M., Lee, J. W., Chase, D., Gebrezgiabhier, D., Liu, A. P. Development of an advanced microfluidic micropipette aspiration device for single cell mechanics studies. Biomicrofluidics. 10 (5), 054105 (2016).
- Weaver, W. M., et al.
- Zhou, E. H., Lim, C. T., Quek, S. T. Finite element simulation of the micropipette aspiration of a living cell undergoing large viscoelastic deformation. Mechanics of Advanced Materials and Structures. 12 (6), 501-512 (2005).
- Oh, M. -J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. Micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness. Journal of Visualized Experiments. (67), e3886 (2012).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. Biophysical journal. 4 (4), 303-316 (1964).
- Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
- Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European Physical Journal E. 14 (2), 149-167 (2004).
- Hochmuth, R. M.
- Pu, H., et al. Micropipette aspiration of single cells for both mechanical and electrical characterization. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 66 (11), 3185-3191 (2019).
- Guevorkian, K., Maître, J. -L. Chapter 10 - Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods in Cell Biology. , 187-201 (2017).
- Biro, M., Maître, J. -L. Chapter 14 - Dual pipette aspiration: A unique tool for studying intercellular adhesion. Methods in Cell Biology. 125, 255-267 (2015).
