Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Primer Sjögren Sendromlu Hastalarda Oral Kandida Enfeksiyonunun İncelenmesi

Published: March 1, 2024 doi: 10.3791/66430
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1, 5,6,7, 1, 8,9, 8,9, 1
1Department of Stomatology, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, 2Beijing Laboratory of Oral Health, Capital Medical University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medicine, Capital Medical University, 4Central Laboratory, National Engineering Laboratory for Digital and Material Technology of Stomatology, Beijing Key Laboratory of Digital Stomatology, Peking University School and Hospital of Stomatology, 5Clinical Diagnosis Laboratory of Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University, 6Key Laboratory for Quality Control of In Vitro Diagnostics, NMPA, 7Beijing Engineering Research Center of Immunological Reagents Clinical Research, 8School of Chinese Medicine, The University of Hong Kong, 9Department of Rheumatology and Clinical Immunology, Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University

Summary

Burada, primer Sjögren sendromlu hastalarda oral Candida enfeksiyonunun incelenmesi için zamanında tedavi ve daha sonra ilgili komplikasyonlardan kaçınmak için kullanılabilecek bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Primer Sjögren sendromu (pSS), ağız kuruluğu, kuru göz ve diğer sistematik semptomlar gibi semptomlarla karakterize otoimmün bir hastalıktır. pSS hastalarının yaşadığı hiposalivasyon nedeniyle, oral dysbacteriosis sıklıkla görülür. pSS'nin yaygın bir komplikasyonu oral Candida enfeksiyonudur. Bu makalede yazarlar, oral Candida enfeksiyonunu etkili bir şekilde teşhis edebilen ve pSS hastalarından tükürük, oral mukozal sürüntüler veya gargara kullanarak Candida suşlarını tanımlayabilen sistematik yöntemleri açıklamaktadır. Oral Candida enfeksiyonunun tanısı için Sabouraud Dekstroz Agar (SDA), hif oluşum testi, potasyum hidroksit (KOH) smear testi ve kalkoflor beyazı (CFW) boyama testi kullanılır. Candida suşlarının tanımlanması için bir Candida tanı agar kullanılır. Son olarak, uygun antifungal ilaç tedavisini belirlemek için antifungal duyarlılık testi kullanılır. Bu standardize edilmiş yöntem, pSS ile ilişkili oral Candida enfeksiyonlarının tanısını, tedavisini ve gelecekteki araştırmalarını geliştirebilir. Bu yöntemi kullanarak erken teşhis, uygun tedavinin alınmasında gecikme nedeniyle ortaya çıkan komplikasyonları da önleyebilir.

Introduction

Kandidiyazis, fırsatçı patojenler olan Candida spp.'den kaynaklanır. Yaygın suşlar arasında Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis ve Candida dubliniensis1 bulunur. Candida spp.'nin neden olduğu fırsatçı enfeksiyonlar yüzeyel Candida enfeksiyonları ve invaziv kandidiyazis içerir. İnvaziv kandidiyazis esas olarak bağışıklığı baskılanmış kişilerde görülür; örneğin, edinilmiş immün yetmezlik sendromu (AIDS) olan hastalarda, invaziv kandidiyazis yaşam kalitesini ve hatta yaşam süresini önemli ölçüde tehdit edebilir2. Mukokutanöz kandidiyazis gibi yüzeysel Kandida enfeksiyonu hastalarda daha sık görülür3.

Yüzeysel bir Candida enfeksiyonu olan oral kandidiyazis, insanlarda en sık görülen mantar enfeksiyonudur. Candida albicans ağzın normal bir kommensalidir; Candida spp.'nin taşıma oranının genel popülasyonda herhangi bir semptom olmaksızın %20 ile %75 arasında değiştiği bildirilmiştir4. Candida'nın aşırı büyümesi, hastalarda duyu tadının değişmesi, ağızda yanma hissi, yetersiz beslenmeye bağlı yutma güçlüğü, gecikmiş iyileşme ve uzun süreli hastanede kalış süresi gibi lokal rahatsızlığa yol açabilir. Uzun süreli oral kandidiyazis ciddi invaziv kandidiyazise yol açarak önemli morbidite ve mortalite ile sonuçlanabilir5. Oral kandidiyazis de ağız kanseri riskini artırabilir5. Bozulmuş tükürük bezi fonksiyonu oral kandidiyazis için risk faktörleri arasındadır6. Enfeksiyonun başlaması, Candida'nın epitel hücre duvarlarına yapışmasıdır. Bunu Candida'nın çoğalması ve filamentasyonu ve biyofilm7'nin oluşumu ve olgunlaşması takip eder. Biyofilmlerin eradike edilmesi son derece zordur ve geleneksel antifungal tedaviye dirençlidir, bu da klinik tedaviyi biyofilm ile ilişkili oral Candida enfeksiyonu için bir zorluk haline getirir7.

Primer Sjögren sendromu (pSS), ağız kuruluğu, kuru göz ve diğer sistematik semptomlarla karakterize otoimmün bir hastalıktır8. Ağız kuruluğu, pSS'nin en sık görülen belirtisidir. Tükürük önemli fizyolojik antifungal fonksiyonlara sahiptir. Bir yandan, ağzı seyreltebilir ve ovalayabilir ve daha sonra organizmaları mukozadan uzaklaştırabilir. Öte yandan tükürük, laktoferrin, sialoperoksidaz, lizozim, histidin açısından zengin polipeptitler gibi antimikrobiyal proteinler ve oral mukoza ile etkileşime girebilen ve Candida6'nın aşırı büyümesini önleyebilen spesifik anti-kandidal antikorlar içerir. Azalan tükürük akışı, pSS hastalarını oral kandidiyazise yatkın hale getirebilir. 61 pSS hastasında yapılan gözlemsel kesitsel bir çalışma, pSS hastalarının %13.1'inin oral kandidiyazis belirtileri gösterdiğini ve Candida albicans'ın koloni oluşturan birimi (CFU)/mL'sinin uyarılmamış tam tükürük (UWS) ve uyarılmış tam tükürük (SWS) seviyeleri ile anlamlı ve negatif ilişkili olduğunu bulmuştur9.

Bu yazıda tanıtılan yöntemler, doğrudan yaymada veya kültürlemeden sonra karakterize edilen morfolojik özelliklere (örneğin, hif ve maya hücreleri) dayalı olarak oral Candida enfeksiyonunu tanımlayabilir10. Candida'nın bir Candida tanısal agar kullanılarak suş tanımlaması, türe özgü enzimler11 tarafından kromojenik substratların bölünmesinden kaynaklanan çeşitli morfolojiye sahip farklı renkli kolonilerin oluşumuna dayanır. Bu yazıda, geleneksel oral Candida kültürü ve potasyum hidroksit (KOH) smear testi ve kalkoflor beyazı (CFW) boyama testi10 ile hızlı inceleme dahil olmak üzere oral Candida enfeksiyonunu tespit etmek için sistematik yöntemler tanıtılmaktadır. Ek olarak, klinik oral Candida enfeksiyonu tedavisine rehberlik edebilecek antifungal duyarlılık testi tanıtılmıştır. Gerçek durumlarda, bu yazıda tanıtılan yöntemlerin tümünün uygulanması gerekli değildir; oral Candida tespit yöntem(ler)i amaca göre seçilebilir. Oral Candida enfeksiyonunun incelenmesi ve pSS hastalarında Candida suşlarının belirlenmesi sadece hastalık tedavisine fayda sağlamakla kalmaz, aynı zamanda oral kandidiyazisin karakterizasyonunun ve tür profillerinin değerlendirilmesine de yardımcı olur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıda açıklanan tüm prosedürler, Başkent Tıp Üniversitesi, Pekin Tiantan Hastanesi Etik Komitesi (NO. KY2023-177-01) tarafından onaylanmıştır ve bu çalışmaya dahil olan tüm hastalar bilgilendirilmiş onam vermiştir.

1. Hasta dahil etme ve dışlama kriterleri

  1. Dahil edilme kriterleri: 2016 Amerikan Romatoloji Koleji (ACR) / Romatizmaya Karşı Avrupa Birliği (EULAR) kriterlerini12 karşılıyorlarsa hastaları pSS hastaları olarak sınıflandırın. Spesifik olarak, nihai sınıflandırma kriterlerini beş öğenin ağırlıklı toplamına dayandırın: anti-SSA/Ro antikor pozitifliği ve fokal lenfositik sialadenit, her biri 3 puan alan ≥ 1 odak/4mm2 odak skoru; 5'≥ anormal Oküler Boyama Skoru (veya ≥ 4'lük van Bijsterveld skoru), ≤ 5 mm / 5 dk'lık bir Schirmer test sonucu ve ≤ 0.1 mL / dk'lık uyarılmamış tükürük akış hızı, her biri 1 puan. SS'yi düşündüren belirti ve/veya semptomları olan ve yukarıdaki maddeler için toplam puanı ≥ 4 olan bireyler pSS kriterlerini karşılamaktadır.
  2. Dışlama kriterleri: Örnek toplama ile işbirliği yapamayan hastaları ve oral Candida enfeksiyonu için tedavi gören hastaları hariç tutun.
    NOT: Aşağıda açıklanan yöntemlerin, sekonder SS'li bireylerde oral Candida enfeksiyonlarının kapsamlı karakterizasyonu için de uygun olduğuna dikkat etmek önemlidir.
  3. Candida numunelerinin toplanması, taşınması ve kültürlenmesi sırasında olası kontaminasyonları önlemek için titiz önlemler alın. Bu, titiz deney hazırlığını, tek kullanımlık ve steril malzemelerin kullanımını, uygun etiketlemeyi, numune alma tüplerinin güvenli bir şekilde kapatılmasını ve profesyonel bir biyogüvenlik kabininde deneysel prosedürlerin yürütülmesini içerir.

2. Örnek toplama

  1. Tükürük toplama: Hastalara tüpü bir huni ile tutmalarını ve tükürüğün alt dudak boyunca yavaş yavaş tüpe akmasına izin vermelerini söyleyin. Toplama işleminin sonunda, hastadan ağızda kalan tüm tükürüğü tüpe tükürmesini isteyin. Tükürüğü 15 dakika boyunca toplayın.
  2. Gargara ve sürüntü toplama: Hastanın uyarılmamış tükürük akışı yoksa veya çok düşükse (0.03 mL / dk'dan az), oral Candida enfeksiyonu şüphesi olan oral mukozal bölgeyi en az 10 kez sürüntü, ardından hastadan 5 mL fosfat tamponlu salin kullanmasını isteyin (PBS; bkz. Malzeme Tablosu) ağzı 1 dakika boyunca çalkalamak için. Gargarayı 50 mL'lik steril bir tüpte saklayın ve swabı gargara tüpüne koyun.
    NOT: 0.03 mL / dakikadan fazla uyarılmamış tükürük akışı olan pSS hastaları için, adım 2.2 oral Candida enfeksiyonu tespiti için numune toplamak için hala kullanılabilir.

3. Numune işleme

  1. Toplanan tükürüğe 1 mL PBS ekleyin. PBS ile gargara içine PBS eklemeyin. Gargara tüpünü 1 dakika boyunca bir girdap kullanarak titreştirin.

4. Candida kültürü

  1. Sabourand'ın Agar (SDA) ortamını yapmak için, 70 g SDA'yı ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1000 mL çift damıtılmış suda çözün.
  2. 121 ° C'de 15 dakika boyunca bir otoklav ile steril hale getirin, bu SDA ortamından 10 mL'yi 10 cm'lik bir mikrobiyolojik kültür kabına koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve soğutun.
  3. Adım 3'te hazırlanan 200 μL numuneyi alın ve adım 4.2'de 10 mL SDA besiyeri ile hazırlanan 10 cm'lik mikrobiyolojik kültür kaplarına sürün.
  4. 37 ° C'de 48 saat kuluçkaya yatın ve Candida kolonisi olgunlaşacaktır. SDA kabını Candida kolonileriyle birlikte geçici olarak 4 °C'de saklayın. SDA kabında kültürlenen Candida kolonileri 2-4 hafta saklanabilir.

5. Candida suş tanımlaması

  1. Ortamı yapmak için 47.7 g Candida diagnostic agar ( Malzeme Tablosuna bakınız) tozunu çıkarın, 1000 mL çift damıtılmış suya koyun ve 100 ° C'ye ısıtın.
  2. Ortam hafifçe kaynadığında, 10 cm'lik bir mikrobiyolojik kültür kabına 10 mL koyun ve soğumaya bırakın.
  3. Candida kolonilerini 500 μL SDA ortamında çözün (adım 4), pipetleme ile askıya alın ve ayrışın.
  4. Candida kolonileri (adım 5.3) ile numunenin 50 μL'sini adım 5.2'de hazırlanan ortam üzerine yerleştirin. Candida kolonileri olgunlaşana kadar 37 ° C'de 48 saat kuluçkaya yatırın.
  5. Candida kolonilerinin rengine ve desenlerine göre, pSS hastalarından edinilen Candida'nın suşlarını belirleyin. Aşağıdaki Candida suşu tanımlama kriterlerini kullanın: zümrüt yeşili koloni Candida albicans, mavi-gri koloni Candida tropicalis, bulanık kenarlı pembe koloniler ve mikrovilluslar Candida krusei, morumsu kırmızı küçük koloni Candida glabrata, süt beyazı koloni Candida parapsilosis dahil olmak üzere çeşitli suşlar içerir.

6. Candida biyofilm oluşum deneyi

  1. Maya Azot Bazını (YNB) -50 glikoz (G) ortamı yapmak için, 1.34 g YNB (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1.98 g D (+)- Glikoz (Malzeme Tablosuna bakınız) ağırlığındadır. Bunları 200 mL çift damıtılmış suda çözün.
  2. YNB-100G ortamını yapmak için 1.34 g YNB ve 3.96 g D (+)- Glikozu çıkarın ve 200 mL çift damıtılmış suda çözün.
  3. Çözeltileri 0,22 μm'lik bir şırınga filtresi ile filtreleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Filtrelenmiş YNB-50G ve YNB-100G ortamı 4 ° C'de 3 ay boyunca saklanabilir.
  4. Adım 5'teki bulaşıkların üzerindeki aynı suştan 3 (veya daha fazla) koloniyi seçin ve bunları 96 oyuklu bir plakada 200 μL YNB-50G ortamına (adım 6.1 ve 6.3) aktarın (bkz. Tabakta gözlenen suşlar için bunu yapın. 200 rpm'de çalkalama ile 37 ° C'de gece boyunca kültür.
  5. Candida süspansiyonunu aspire edin, 1 mL PBS ekleyin, maya hücrelerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1500 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Bu adımı aynı tüpte 2 kez tekrarlayın.
  6. Hücreleri 1 mL YNB-100G ortamında yeniden süspanse edin ve hücrelerin farklı seyreltmelerini (1:10, 1:100 ve 1:1000) hazırlayın. 200 μL gradyan hücre süspansiyonu alın ve spiral plaka yöntemi13 ile 10 cm SDA ortamına plakalayın. Kaplama, bir Arşimet spirali şeklinde giderek azalan bir miktarda dönen bir agar plakası üzerine bilinen bir hacimde numune bırakan bir makine kullanılarak yapılır. 37 ° C'de 24-48 saat kültür.
  7. Standart bir yönteme dayalı olarak SDA plakasındaki CFU sayısına göre farklı seyreltmelerdeki hücrelerin konsantrasyonunu hesaplayın13. Her plakada iyi ayrılmış kolonileri kısaca sayın. En az 25 koloni gözlenene kadar kolonileri dış kenardan merkeze doğru bir oktant halinde sayın. Ayrıca, 25. sayımın gerçekleştiği yayın geri kalanını da sayın. Koloni sayısını, koloni sayımının elde edildiği alana karşılık gelen sıvı hacmine bölerek hücrelerin konsantrasyonunu hesaplayın13. Hücre konsantrasyonunu 1 x 107 hücre / mL'ye ayarlayın.
  8. YNB-100G'de 100 μL hücre süspansiyonunu 96 oyuklu bir plakaya koyun ve 200 rpm'de sallarken 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
  9. Süpernatanı dikkatli bir şekilde çıkarın, 2x'i PBS ile yıkayın ve yüzen maya hücrelerini uzaklaştırın. Candida biyofilmi, 96 oyuklu plakanın dibinde oluşur.

7. Hif oluşumu deneyi

NOT: Sadece hif oluşturabilen Candida ( Candida albicans gibi) hif oluşumu için indüklenebilir. Hif oluşturamayan Candida'nın ( Candida glabrata gibi) daha fazla karakterizasyonu için 8. adıma gidin.

  1. Adım 6.6'da maya hücresi süspansiyonunu yeniden süspanse edin ve hücre konsantrasyonunu YNB-100G ortamı ile 1 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın.
  2. RPMI 1640 tam büyüme ortamını hazırlamak için, 450 mL RPMI 1640 ortamına (Malzeme Tablosuna bakınız) 50 mL Fetal Sığır Serumu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve daha fazla deney için 4 ° C'de saklayın.
  3. 200 μL RPMI 1640 tam büyüme ortamında seyreltilmiş 2 μL Candida hücre süspansiyonunu 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve hif ve maya hücrelerinin oluşmasına izin vermek için gece boyunca 37 ° C'de kültürleyin.

8. KOH smear testi ve CFW boyama testi

  1. Hassas kalıplanmış bir halka kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın) adım 3 veya adım 6 veya adım 7'den 1 μL numune alın ve cam slaytların üzerine 1 cm x 1 cm'lik bir alan sürün. Oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
  2. % 10 KOH çözeltisi yapmak için, 10 g KOH tozunu tartın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 100 mL çift damıtılmış suda çözün.
  3. Numune eriyene kadar slaytı bir alkol lambası ile hafifçe ısıtın. Adım 8.1'de hazırlanan slaytları %10 KOH (adım 8.2) ile boyayın ve bir kapak fişi ile örtün. Numuneyi şeffaf hale getirmek için kapak fişine hafifçe bastırın.
  4. Hif ve maya hücrelerini mikroskop altında görselleştirin.
  5. Adım 8.1'de hazırlanan slaytları bir damla CFW ile lekeleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), bir lamel ile örtün ve 1 dakika bekleyin.
  6. 100x ve 200x büyütme oranlarında bir floresan mikroskobu kullanarak hifleri görselleştirin. CFW 355 nm'de uyarılır ve 300-440 nm'de tespit edilir. Görüntüleri pozlama süresi altında fotoğraflayın. Yanlış pozitif sonuçları önlemek için 3x tekrarlayın.

9. Antifungal duyarlılık testi

NOT: Bu test, üreticinin Maya Benzeri Mantar Duyarlılık Kiti (Mikroseyreltme; bkz . Malzeme Tablosu) talimatlarına göre gerçekleştirilir.

  1. % 0.85 NaCl ampul ile 4 günden daha eski Candida kolonilerini (adım 4) hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 2 McFarland'a eşdeğer bulanıklığa sahip süspansiyonu elde edin. Bulanıklığı McFarland Standartları Kitine göre belirleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Hazırlanan Candida süspansiyonunu anında kullanın.
  2. Test şeridindeki her bir cupüle 3 x 104 maya hücresi / mL içeren kitte 135 μL ATB F2 besiyerini pipetleyin ve kapağını kapatın. Test şeridini kapalı bir kaba koyun. 35 ° C'de 24 saat kültür.
  3. Görsel yorumlama ile Candida'nın büyümesini gözlemleyin (kullanım kılavuzuna bakın). Referans değeri (referans aralığı) için kullanım kılavuzuna bakın. Kontrol deliğinin yeterince büyüyüp büyümediğini kontrol edin. Kontrol deliğinin büyümesi yetersizse veya büyümezse, sonuçlar okunamaz ve 24 saatlik bir ekime ihtiyaç duyar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışmada, pSS'li 12 hasta temsili hasta olarak seçildi ve oral Candida enfeksiyonu açısından tarandı (Tablo 1). Bu hastalar arasında, bazı hastalarda açısal keilit (ağız köşelerinde çatlaklar, deskuamasyon ve hiperemi ile karakterize, Şekil 1A), dişeti mukozasında parlak kırmızı ödem, sarımsı beyaz lifli psödo-membran (Şekil 1B), lingual papilla atrofisi ve dilin parlak kırmızı dorsal mukozası (Şekil 1C) dahil olmak üzere Candida enfeksiyonunun tipik oral lezyonları sergilendi.

Bu çalışmaya katılan bu 12 hastadan 8'inde oral Candida enfeksiyonu vardı ve bu, SDA kaplarında Candida kolonilerinin büyümesi ile doğrulandı (Şekil 2A-C ve Ek Şekil 1). Tanısal agar, bu pSS hastaları arasında Candida albicans, Candida krusei ve Candida glabrata oral Candida enfeksiyonlarının bulunduğunu gösterdi (Şekil 2D-F, Ek Şekil 2A, B). Bazı durumlarda, Candida albicans ve Candida krusei ile kombinasyon enfeksiyonu ve ayrıca Candida albicans ve Candida glabrata ile kombinasyon enfeksiyonu gibi birden fazla Candida türü tespit edilmiştir (Şekil 2D, Ek Şekil 2A, B).

KOH smear testi ve müteakip CFW boyama testi, hasta tükürüğü veya oral mukozal sürüntü örneklerini kullanarak, hastanın oral Candida enfeksiyonu olup olmadığını hızlı bir şekilde belirleyebilir. Bu çalışmada, pSS hastalarından alınan her iki oral örnekte de hif varlığı gözlenmiştir (Şekil 3A,B). Bulgu, hiflerin floresan pozitif boyanmasını sergileyen CFW boyama testi ile daha da doğrulandı (Şekil 3C, D). Ek olarak, oral Candida albicans ile enfekte olmuş bir pSS hastasının hifleri, hif oluşum testi ile indüklenebilirdi (Şekil 4A) ve indüklenen hifler, CFW boyama testinde floresan mikroskobu altında gözlendi (Şekil 4D). Ayrıca, KOH smear testi ve CFW boyama testi, Candida krusei enfeksiyonu olan bir pSS hastasından pozitif mantar sporları ve psödohif (Şekil 4B, E) ve Candida glabrata enfeksiyonu olan bir pSS hastasından (Şekil 4C, F) mantar sporları gösterdi.

Antifungal duyarlılık testi, pSS'li hastalarda oral Candida enfeksiyonlarının klinik yönetimine rehberlik etmede çok önemlidir. Burada, üç temsili hasta, yaygın olarak reçete edilen beş ajana karşı antifungal duyarlılık açısından test edildi: Flukonazol, Itrakonazol, Amfoterisin B, Vorikonazol ve 5-Flukonazol. Sonuçlar, üreticinin yönergelerine göre yorumlandı. pSS hastaları 1 ve 3, test edilen tüm antifungal ajanlara karşı duyarlılık gösterdi (Tablo 1)14,15. pSS hasta 2, Flukonazol ve Vorikonazole doza bağımlı, Itrakonazole karşı doza bağımlı, orta ila dirençli duyarlılık, 5-flukonazole direnç ve Amfoterisin B tedavisine duyarlılık gösterdi (Tablo 2)14,15.

Figure 1
Şekil 1: Oral Candida enfeksiyonunun temsili oral belirtileri. (A) Açısal keilit (ağzın köşelerinde rhagades, deskuamasyon ve hiperemi). (B) Alveoler dişeti mukozasında ödemli, sarımsı beyaz lifli yalancı membranlı eritemli bir lezyon. (C) Dağınık ve düzensiz kızarık ve sınırlı atrofik eritem lezyonu ile lingual papillaların atrofik dorsosu. Siyah oklar lezyonları gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Sabouraud dekstroz agar (SDA) ve Candida suşu tanımlaması. (A-C) Candida enfeksiyonu olan 3 temsili pSS hastasından alınan oral örneklerin (tükürük, PBS gargara veya oral mukoza takası) SDA kültürü. Candida tanısal agar kullanılarak yapılan Candida suşu tanımlama testi, oral (D) Candida albicans artı Candida Krusei enfeksiyonları, (E) Candida albicans enfeksiyonu ve (F) Candida glabrata enfeksiyonu olan pSS hastalarını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Anlık potasyum hidroksit (KOH) smear testi ve kalkoflor beyazı (CFW) boyama testi. Test, 2 temsili pSS hastasından alınan oral örnekler (tükürük, PBS gargara veya oral mukoza takası) kullanılarak gerçekleştirildi. (A) pSS hasta 1 ve (B) pSS hasta 2'den alınan oral örnek kullanılarak KOH smear testi. Siyah, içi boş oklar hifleri gösterir. (C) pSS hasta 1 ve (D) pSS hasta 2'den alınan oral örnek kullanılarak CFW boyama testi. Beyaz içi boş oklar, hiflere ve mantar sporlarına işaret eder. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Potasyum hidroksit (KOH) smear testi, kültür sonrası numunelerin kalkoflor beyazı (CFW) boyama testi. (A) Candida albicans enfeksiyonu olan pSS hastası, (B) Candida krusei enfeksiyonu olan pSS hastası ve (C) Candida glabrata enfeksiyonu olan pSS hastasından alınan tükürük kullanılarak yapılan KOH smear testi. (D) Candida albicans enfeksiyonu olan pSS hastasından indüklenen hiflerin, Candida krusei enfeksiyonu olan (E) pSS hastasından mantar sporları ve psödo-hiflerin ve Candida glabrata enfeksiyonu olan (F) pSS hastasından mantar sporlarının CFW boyama testi. Beyaz içi boş oklar hifleri gösterir; Beyaz katı oklar yalancı hifa'ya işaret eder. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: pSS hastası oral örnekleri (tükürük, PBS gargara veya oral mukoza takası) kullanılarak temsili Sabouraud dekstroz agar (SDA) kültürü. (A-C) 3 temsili pSS hastasından alınan oral örnekler kullanılarak Candida'nın SDA kültürü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Candida suşu tanımlaması. Bir Candida tanısal agar kullanılarak 12 pSS hastasından olası enfekte Candida'nın tanımlanması. (A) pSS hastaları 1-6'dan alınan oral örnekler kullanılarak Candida suşunun tanımlanması. pSS hastası 1: Candida albicans, 2: Candida albicans, 3: Candida albicans ve Candida krusei, 4: Candida albicans, 5: Candida albicans ve Candida glabrata, 6: oral Candida enfeksiyonu yok. (B) pSS hastalarından alınan oral örnekler kullanılarak Candida suşunun tanımlanması 7-12. pSS hastası 7: Candida albicans, 8: Candida albicans ve Candida glabrata, 9: oral Candida enfeksiyonu yok, 10: Candida albicans, 11: oral Candida enfeksiyonu yok, 12: oral Candida enfeksiyonu yok. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Primer Sjögren sendromlu hastaların bilgileri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Hastaların antifungal duyarlılık test sonuçları14,15. Kısaltmalar: S = hassas, I = orta, R = dirençli, SDD = doza bağlı hassas, C = konsantrasyon. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makalede, oral Candida enfeksiyonlarını tespit etmek, Candida suşlarını tanımlamak ve pSS'li hastalarda yaygın olarak kullanılan ilaçların antifungal duyarlılığını test etmek için bir dizi sistematik, basit ve uygulanabilir yöntem sunuyoruz.

Pratik ortamlarda, bu el yazmasında tanıtılan tüm yöntemler gerekli değildir. Oral Candida tespit yöntemi/yöntemleri, belirli bir amaca göre seçilebilir. KOH smear testleri ve CFW boyama testleri, kültürleme yapılmadan numuneler kullanılarak, pSS hastalarında oral Candida enfeksiyonunun varlığını hızlı ve erken bir şekilde belirleyebilir. Bununla birlikte, bu yöntemler nispeten yüksek bir yanlış negatif oranına sahiptir16. Enfeksiyonu doğrulamak zorsa, Candida kültürü esastır. İlaç direnci, tedavi sırasında göz önünde bulundurulması gereken bir faktördür; bazı Candida suşları, bazı antifungal ilaçlara doğal olarak dirençlidir, örneğin, Candida krusei , Flukonazol17 ile tedaviye doğal olarak dirençlidir. Bu nedenle, bazen, Candida suşunun tanımlanması gerekir. Bu durumda, Candida suşu bir Candida tanısal agar ile tanımlanabilir. Şu anda, ilaca dirençli Candida giderek daha fazla dikkat çekiyor18. Antifungal duyarlılık testi tedaviye rehberlik edebilir ve böylece tedavi sırasında ilaç direncinden mümkün olduğunca kaçınabilir. Candida biyofilm oluşumu testi ve hif oluşumu testi, oral Candida enfeksiyonu ile ilgili araştırmalar için uygundur.

Oral Candida enfeksiyonu, pSS hastalarında4 en sık görülen komplikasyonlardan biridir ve neden olduğu semptomlar dizisi nedeniyle yaşam kalitelerini önemli ölçüde etkiler. Özellikle, pSS hastaları bu enfeksiyona karşı oldukça hassastır ve etkili tedavi genellikle sistemik tedavi ve hasta işbirliği gerektirir19. Sonuç olarak, oral Candida enfeksiyonları bu popülasyonda sıklıkla tekrarlanır. Tedaviye rehberlik etmek için oral kandidiyazisi tanımlamak ve antifungal duyarlılık testleri yapmak çok önemlidir. Bu yazıda detaylandırılan yöntemler arasında, Candida tespiti için oral örneklerin toplanması ve ardından kültürleme en kritik adımlardır.

Ayrıca, hif oluşumuna sahip Candida (Candida albicans gibi), kültür yapılmadan toplanan örnekler kullanılarak hızlı KOH smear testi ve CFW boyama testi ile kolayca tespit edilebilir. Oral Candida enfeksiyonlarının çoğu bu yazıda tanıtılan yöntemlerle tespit edilebilse ve Candida suşları tanımlanabilse de, bazı Candida suşları diğerlerinden spesifik olarak yalnızca SDA kültürü, Candida tanısal agar kültürü, Candida biyofilm oluşum testi ve hif oluşumu testi gibi yöntemlerle tanımlanamaz. Ek olarak, Candida glabrata gibi bazı Candida suşları, hif üretmeye teşvik edilemez. 18s rDNA RT-PCR tabanlı tür tanımlaması, Candida türlerini genetik benzerliklerine göre doğru bir şekilde tanımlayabilir 10,20,21. Gerekirse, 18s rDNA RT-PCR tabanlı tür tanımlaması, örneğin pSS hastalarında oral Candida enfeksiyonu ile ilgili araştırmalarda kullanılabilir.

Ağız içi olarak, Candida enfeksiyonunun tezahürü eritematöz mukozal lezyonlar, protez stomatiti ve dilin fissürlenmesi olarak ortaya çıkabilir. Perioral bölgede, Candida'nın kolonizasyonu kuru, çatlamış ve eritemli bir görünüme neden olur7. Bildirilen klinik oral kandidiyazis prevalansı, SS hastalarında %0 ile %80 arasında değişmekle birlikte büyük ölçüde değişmektedir. Oral kandidiyazisin büyük varyasyonunun olası nedenleri arasında net semptomatolojinin olmaması ve daha da önemlisi literatürde oral kandidiyazis tanısı için kullanılan farklı kriterler yer alır 8,9,12. Ayrıca, Candida enfeksiyonu olan hastaların daha yüksek SS riskine sahip olduğu bildirilmektedir ve Candida enfeksiyonu, sonraki SS22'nin erken bir belirtisi olarak hareket edebilir. pSS'nin erken tanısı, tedavi ve patolojik çalışma için çok önemlidir. Bu nedenle, pSS hastalarında oral Candida enfeksiyonunu tanımlamak için evrensel, uygun ve uygulanabilir yöntemler sağlamak zorunludur.

pSS hastalarında bağırsak, oral ve vajinal mikrobiyomda disbiyoz sık görülse de, oral örnekler mikrobiyal varyasyonun en büyük derecesini göstermektedir1. Normal koşullar altında, tüm tükürüğün ortalama günlük akışı 1 ila 1,5L2'dir. Tükürüğün %99 kadarı sudan, kalan %1'i ise protein ve iyonlardan oluşur. Tükürüğün, birçok nedenden dolayı oral mikrobiyotanın bileşiminin ve aktivitesinin belirlenmesinde önemli bir rol oynadığı bildirilmektedir3. Tükürük sadece dişleri sürekli olarak temizlemekle kalmaz, aynı zamanda sağlıklı koşullarda önemli ağız hijyeni işlevlerini yerine getirir, aynı zamanda ağız yüzeylerinde bir bakım filmi oluşturur. Bu film, bakterilerin bağlanması için reseptörler sağlar, bakterilere glikoproteinlerden besin sağlayarak bakterilerin büyümesine yardımcı olur ve bakteri büyümesi için uygun bir pH sağlar. Ek olarak, tükürük, mikrobiyotayı düzenleyen ve şekillendiren antimikrobiyal ve anti-kandidal faktörler içerir. Ayrıca tükürük, mikrobiyotayı düzenleyen ve şekillendiren adrenomedullin, statherin, histatinler, α-defensinler, lizozim, histatinler, laktoferrin ve kalprotektin gibi antimikrobiyal ve anti-kandidal faktörler içerir4. pSS, otoimmün deregülasyon ve glandüler hipofonksiyon ile karakterizedir. Tükürük akışında bir azalma olan hiposalivasyon, pSS'nin en yaygın semptomlarından biridir. Azalmış tükürük pH seviyeleri ve akışı, oral Candida enfeksiyonları için önemli risk faktörleridir5. Ayrıca, Candida enfeksiyonları SS6 ile ilişkili ikinci en sık görülen orofasiyal komplikasyon olarak bildirilmektedir. Yazarlar, pSS hastalarında artmış Candida enfeksiyonlarının sadece tükürük üretiminin azalmasıyla değil, aynı zamanda SS'nin doğasında bulunan immünolojik deregülasyonla da bağlantılı olabileceğini öne sürmektedir.

Sonuç olarak, bu yazıda tanıtılan oral Candida enfeksiyonu ve antifungal duyarlılık testleri için pratik ve tekrarlanabilir yöntemler, Candida enfeksiyonlarının klinik tanımlamasını ve tedavisini geliştirmek için umut vaat etmektedir. Ayrıca, bu standartlaştırılmış prosedürler oral kandidiyazis ile ilgili araştırma çalışmalarında tutarsızlıkları en aza indirebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu araştırma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82201084), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2022M722232), Pekin Doktora Sonrası Araştırma Vakfı (2023-ZZ-020), Pekin Tiantan Hastanesi Miaopu Projesi, Başkent Tıp Üniversitesi (2023MP10) ve Hong Kong Araştırma Hibeleri Konseyi (27111820 ve 17116521) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Syringe Filter MERCK SLGV004SL
1.5 mL Centrifuge Tube axygen MCT-150-C-S
10 cm Microbiological Culture Dishes Jet Bio-Filtration Co. Ltd TCD000100
15 mL Centrifuge Tube Jet Bio-Filtration Co., Ltd CFT011150
50 mL Centrifuge Tube Corning 430290
96-well Microplates Corning 3599
API 0.85% NaCl ampule BIOMERIEUX 20070
Calcofluor White Stain Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
CHROMagar Candida CHROMagar P002860 Candida diagnostic agar
D(+)-Glucose Monohydrate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010518
Fetal Bovine Serum  Gibco 26170035
McFarland Standards Kit BIOMERIEUX 70900
Nunc precision molded loops  ThermoFisher Scientific 254399
Phosphate Buffered Saline Gibco C10010500BT
Potassium Hydroxide Aladdin P112284-500g
PowerSoil DNA Isolation Kit  MO BIO 12888-50
RPMI 1640 Medium Gibco 11875119
Sabourand's Agar Medium Solarbio S9710
Yeast Nitrogen Base Without Amino acids Solarbio Y8040
Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution) BIOMERIEUX 14204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., et al. Microbiota dysbiosis in primary Sjögren's syndrome and the ameliorative effect of hydroxychloroquine. Cell Rep. 40 (11), 111352 (2022).
  2. Humphrey, S. P., Williamson, R. T. A review of saliva: normal composition, flow, and function. J Prosthet Dent. 85 (2), 162-169 (2001).
  3. Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontol 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
  4. Vila, T., Rizk, A. M., Sultan, A. S., Jabra-Rizk, M. A. The power of saliva: Antimicrobial and beyond. PLoS Pathog. 15 (11), e1008058 (2019).
  5. Serrano, J., et al. Risk factors related to oral candidiasis in patients with primary Sjögren's syndrome. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 25 (5), e700-e705 (2020).
  6. Napeñas, J. J., Rouleau, T. S. Oral complications of Sjögren's syndrome. Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 26 (1), 55-62 (2014).
  7. Mathews, S. A., Kurien, B. T., Scofield, R. H. Oral manifestations of Sjögren's syndrome. J Dent Res. 87 (4), 308-318 (2008).
  8. Leung, K. C. M., McMillan, A. S., Cheung, B. P. K., Leung, W. K. Sjögren's syndrome sufferers have increased oral yeast levels despite regular dental care. Oral Dis. 14 (2), 163-173 (2008).
  9. Lundstrom, I. M., Lindstrom, F. D. Subjective and clinical oral symptoms in patients with primary Sjögren's syndrome. Clin Exp Rheumatol. 13 (6), 725-731 (1995).
  10. Alam, M. Z., et al. Candida identification: a journey from conventional to molecular methods in medical mycology. World J Microbiol Biotechnol. 30 (5), 1437-1451 (2014).
  11. Bauters, T. G., Nelis, H. J. Comparison of chromogenic and fluorogenic membrane filtration methods for detection of four Candida species. J Clin Microbiol. 40 (5), 1838-1839 (2002).
  12. Soto-Rojas, A. E., Villa, A. R., Sifuentes-Osornio, J., Alarcón-Segovia, D., Kraus, A. Oral candidiasis and Sjögren's syndrome. J Rheumatol. 25 (5), 911-915 (1998).
  13. Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Appl Microbiol. 25 (2), 244-252 (1973).
  14. Biomerieux. ATB FUNGUS 3 Sensitivity test for yeast-like fungi. REF 14204. Biomerieux. , (2014).
  15. Zhang, L., et al. The widely used ATB FUNGUS 3 automated readings in China and its misleading high MICs of Candida spp. to Azoles: Challenges for developing countries' clinical microbiology labs. PLoS One. 9 (12), e114004 (2014).
  16. Hu, L., Zhou, P., Zhao, W., Hua, H., Yan, Z. Fluorescence staining vs. routine KOH smear for rapid diagnosis of oral candidiasis-A diagnostic test. Oral Dis. 26 (5), 941-947 (2020).
  17. Samaranayake, L. P. Candida krusei infections and fluconazole therapy. Hong Kong Med J. 3 (3), 312-314 (1997).
  18. Lee, Y., Puumala, E., Robbins, N., Cowen, L. E. Antifungal drug resistance: Molecular mechanisms in Candida albicans and beyond. Chem Rev. 121 (6), 3390-3411 (2021).
  19. Rihab, B., Lina, E. H., Noémie, S. T., Jean, S., Marjolaine, G. The experience of dry mouth and screening for Sjogren's syndrome by the dentist: patient-reported experiences. BMC Oral Health. 23 (1), 1010 (2023).
  20. Panpetch, W., et al. Oral Candida administration in a Clostridium difficile mouse model worsens disease severity but is attenuated by Bifidobacterium. PLoS One. 14 (1), e210798 (2019).
  21. Alwaily, E. R., Abood, M. S., Al Uobody, R. M. Diagnosis of oral candidiasis in patients under 12 years: 18S rRNA as a marker of molecular characterization of Candida tropicalis. Arch Razi Inst. 78 (1), 475-483 (2023).
  22. Chen, C. L., et al. Candida infection as an early sign of subsequent Sjögren's syndrome: A population-based matched cohort study. Front Med (Lausanne). 8, 796324 (2022).

Tags

Tıp Sayı 205
Primer Sjögren Sendromlu Hastalarda Oral <i>Kandida</i> Enfeksiyonunun İncelenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, X., Song, Y., Lou, X., Han,… More

Wang, X., Song, Y., Lou, X., Han, B., Wu, R., Xie, J., Lin, X., Wang, H. Examination of Oral Candida Infection in Primary Sjögren's Syndrome Patients. J. Vis. Exp. (205), e66430, doi:10.3791/66430 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter