Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para o exame da infecção oral por Candida em pacientes com síndrome de Sjögren primária, que pode ser usado para tratamento oportuno e, posteriormente, evitando complicações relacionadas.
Abstract
A síndrome de Sjögren primária (SSp) é uma doença autoimune caracterizada por sintomas como boca seca, olhos secos e outros sintomas sistemáticos. Devido à hipossalivação experimentada por pacientes com SSP, freqüentemente ocorre disbacteriose oral. Uma complicação comum da SSp é a infecção oral por Candida . Neste artigo, os autores descrevem métodos sistemáticos que podem diagnosticar efetivamente a infecção oral por Candida e identificar as cepas de Candida usando saliva, esfregaços de mucosa oral ou enxaguatório bucal de pacientes com SSP. O ágar dextrose de Sabouraud (SDA), o ensaio de formação de hifas, o teste de esfregaço de hidróxido de potássio (KOH) e o ensaio de coloração branca de calcofluor (CFW) são usados para o diagnóstico de infecção oral por Candida . Um ágar diagnóstico de Candida é usado para a identificação de cepas de Candida . Finalmente, o teste de suscetibilidade antifúngica é usado para determinar o tratamento adequado com medicamentos antifúngicos. Este método padronizado pode melhorar o diagnóstico, o tratamento e a pesquisa futura de infecções orais por Candida relacionadas à SSp. O diagnóstico precoce, usando este método, também pode prevenir quaisquer complicações decorrentes do atraso no tratamento adequado.
Introduction
A candidíase é causada por Candida spp., que são patógenos oportunistas. As cepas comuns incluem Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis e Candida dubliniensis1. As infecções oportunistas causadas por Candida spp. incluem infecções superficiais por Candida e candidíase invasiva. A candidíase invasiva ocorre principalmente em indivíduos imunocomprometidos; por exemplo, em pacientes com síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), a candidíase invasiva pode ameaçar significativamente a qualidade de vida ou mesmo a expectativa de vida2. A infecção superficial por Candida , como a candidíase mucocutânea, é mais comum em pacientes3.
A candidíase oral, uma infecção superficial por Candida , é a infecção fúngica humana mais comum. Candida albicans é um comensal normal da boca; a taxa de transporte de Candida spp. foi relatado como variando de 20% a 75% na população em geral sem nenhum sintoma4. O crescimento excessivo de Candida pode levar a desconforto local nos pacientes, como paladar alterado da sensação, sensação de queimação na boca, disfagia devido à má nutrição, recuperação retardada e internação prolongada. A candidíase oral a longo prazo pode levar à candidíase invasiva grave, resultando em morbidade e mortalidade significativas5. A candidíase oral também pode aumentar o risco de câncer bucal5. A função das glândulas salivares prejudicada está entre os fatores de risco para candidíase oral6. O início da infecção é a adesão de Candida às paredes celulares epiteliais. Isso é seguido pela proliferação e filamentação de Candida e pela formação e maturação do biofilme7. Os biofilmes são extremamente difíceis de erradicar e são resistentes ao tratamento antifúngico convencional, tornando o tratamento clínico um desafio para a infecção oral por Candida associada ao biofilme7.
A síndrome de Sjögren primária (SSp) é uma doença autoimune caracterizada por boca seca, olhos secos e outros sintomas sistemáticos8. A boca seca é o sintoma mais frequente da SSP. A saliva tem importantes funções antifúngicas fisiológicas. Por um lado, pode diluir e vasculhar a boca e, posteriormente, remover organismos da mucosa. Por outro lado, a saliva contém proteínas antimicrobianas, como lactoferrina, sialoperoxidase, lisozima, polipeptídeos ricos em histidina e anticorpos anti-candida específicos, que podem interagir com a mucosa oral e prevenir o crescimento excessivo de Candida6. O fluxo salivar reduzido pode predispor os pacientes com SSp à candidíase oral. Um estudo observacional transversal realizado em 61 pacientes com SSp constatou que 13,1% dos pacientes com SSp apresentavam sinais orais de candidíase e a unidade formadora de colônias (UFC)/mL de Candida albicans foi encontrada significativa e negativamente correlacionada com os níveis de saliva total não estimulada (UWS) e saliva total estimulada (SWS)9.
Os métodos introduzidos neste manuscrito podem identificar a infecção oral por Candida com base em atributos morfológicos caracterizados (por exemplo, hifas e células de levedura) em esfregaço direto ou após cultura10. A identificação da cepa de Candida usando um ágar diagnóstico de Candida é baseada na formação de colônias de diferentes cores com morfologia variada, que resultam da clivagem de substratos cromogênicos por enzimas espécie-específicas11. Neste manuscrito, são introduzidos métodos sistemáticos para detectar a infecção oral por Candida , incluindo a cultura oral tradicional de Candida e o exame rápido por teste de esfregaço de hidróxido de potássio (KOH) e ensaio de coloração branca de calcofluor (CFW)10. Além disso, foi introduzido o teste de suscetibilidade antifúngica, que pode orientar o tratamento clínico oral da infecção por Candida . Em situações reais, não é necessário executar todos os métodos introduzidos neste manuscrito; o(s) método(s) de detecção oral de Candida pode(m) ser selecionado(s) de acordo com a finalidade. O exame da infecção oral por Candida e a determinação de cepas de Candida em pacientes com SSp não apenas beneficiam o tratamento da doença, mas também ajudam a avaliar a caracterização da candidíase oral e os perfis das espécies.
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Protocol
Todos os procedimentos descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Ética do Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University (NO. KY2023-177-01), e todos os pacientes envolvidos neste estudo forneceram consentimento informado.
1. Critérios de inclusão e exclusão de pacientes
- Critérios de inclusão: Classificar os pacientes como pacientes com SSp se eles preencherem os critérios de 2016 do American College of Rheumatology (ACR)/European League Against Rheumatism (EULAR)12. Especificamente, basear os critérios de classificação final na soma ponderada de cinco itens: positividade de anticorpos anti-SSA/Ro e sialadenite linfocítica focal com escore focal de ≥ 1 foco/4mm2, cada um com escore 3; um escore de coloração ocular anormal de ≥ 5 (ou escore de van Bijsterveld de ≥ 4), um resultado do teste de Schirmer de ≤ 5 mm/5 min e uma taxa de fluxo salivar não estimulado de ≤ 0,1 mL/min, cada um pontuando 1. Indivíduos com sinais e/ou sintomas sugestivos de SS que têm uma pontuação total de ≥ 4 para os itens acima atendem aos critérios para SSp.
- Critério de exclusão: Excluir pacientes que não podem cooperar com a coleta de amostras e pacientes que estão recebendo tratamento para infecção oral por Candida .
NOTA: É essencial observar que os métodos descritos abaixo também são adequados para a caracterização abrangente de infecções orais por Candida em indivíduos com SS secundária. - Para evitar possíveis contaminações durante a coleta, transporte e cultura de amostras de Candida , tome precauções meticulosas. Isso inclui preparação experimental meticulosa, uso de materiais descartáveis e estéreis, rotulagem adequada, vedação segura de tubos de amostragem e realização de procedimentos experimentais em um gabinete de biossegurança profissional.
2. Coleta de amostras
- Coleta de saliva: Instrua os pacientes a segurar o tubo com um funil e deixar a saliva fluir gradualmente para dentro do tubo ao longo do lábio inferior. No final da coleta, peça ao paciente para cuspir toda a saliva restante na boca no tubo. Colete a saliva por 15 min.
- Enxaguatório bucal e coleta de swab: Se o paciente não tiver fluxo de saliva não estimulado ou tiver fluxo de saliva não estimulado extremamente baixo (menos de 0,03 mL / min), esfregue a área da mucosa oral com suspeita de infecção oral por Candida pelo menos 10 vezes e, em seguida, peça ao paciente para usar 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS; ver Tabela de Materiais) para enxaguar a boca por 1 min. Guarde o enxaguatório bucal em um tubo estéril de 50 mL e coloque o cotonete no tubo de enxaguatório bucal.
NOTA: Para pacientes com SSp com fluxo de saliva não estimulado superior a 0,03 mL / min, a etapa 2.2 ainda pode ser usada para coletar amostras para detecção de infecção oral por Candida .
3. Processamento de amostras
- Adicione 1 mL de PBS à saliva coletada. Não adicione PBS no enxaguatório bucal com PBS. Vibre o tubo de enxaguatório bucal usando um vórtice por 1 min.
4. Cultura de Candida
- Para fazer o meio de ágar Sabourand (SDA), dissolva 70 g de SDA (ver Tabela de Materiais) em 1000 mL de água bidestilada
- Estéril com autoclave a 121 °C por 15 min, coloque 10 mL deste meio SDA em uma placa de cultura microbiológica de 10 cm (consulte a Tabela de Materiais) e resfrie.
- Pegue 200 μL de amostra preparada na etapa 3 e coloque-a nas placas de cultura microbiológica de 10 cm preparadas com 10 mL de meio SDA na etapa 4.2.
- Incube por 48 h a 37 ° C e a colônia de Candida amadurecerá. Conservar temporariamente a placa SDA com colónias de Candida a 4 °C. As colônias de Candida cultivadas na placa SDA podem ser armazenadas por 2-4 semanas.
5. Identificação da cepa de Candida
- Para fazer o meio, retire 47,7 g de pó de ágar diagnóstico de Candida (ver Tabela de Materiais), coloque-o em 1000 mL de água bidestilada e aqueça-o a 100 ° C.
- Quando o meio estiver ligeiramente em ebulição, colocar 10 ml numa placa de cultura microbiológica de 10 cm e deixar arrefecer.
- Dissolva as colônias de Candida em 500 μL de meio SDA (etapa 4), suspenda e dissocie por pipetagem.
- Colocar 50 μL da amostra com colônias de Candida (etapa 5.3) no meio preparado na etapa 5.2. Incubar durante 48 h a 37 °C até que as colónias de Candida estejam maduras.
- De acordo com a cor e os padrões das colônias de Candida , determine a(s) cepa(s) da Candida adquirida de pacientes com SSP. Use os seguintes critérios de identificação da cepa de Candida : a colônia verde-esmeralda é Candida albicans, a colônia cinza-azulada é Candida tropicalis, as colônias rosa com bordas difusas e as microvilosidades são Candida krusei, a pequena colônia vermelha arroxeada é Candida glabrata, a colônia branca leitosa contém várias cepas, incluindo Candida parapsilosis.
6. Ensaio de formação de biofilme de Candida
- Para fazer o meio de glicose (G) à Base de Nitrogênio de Levedura (YNB)-50, pese 1,34 g YNB (ver Tabela de Materiais) e 1,98 g D (+)-Glicose (ver Tabela de Materiais). Dissolva-os em 200 mL de água bidestilada
- Para fazer o meio YNB-100G, retire 1,34 g de YNB e 3,96 g de D (+) -Glicose e dissolva-os em 200 mL de água bidestilada
- Filtre as soluções com um filtro de seringa de 0,22 μm (consulte a Tabela de Materiais). Os meios filtrados YNB-50G e YNB-100G podem ser armazenados a 4 °C por 3 meses.
- Escolha as 3 (ou mais) colônias da mesma cepa nas placas na etapa 5 e transfira-as para 200 μL de meio YNB-50G (etapas 6.1 e 6.3) em uma placa de 96 poços (consulte a Tabela de Materiais). Faça isso para as cepas observadas no prato. Cultura durante a noite a 37 °C com agitação a 200 rpm.
- Aspire a suspensão de Candida , adicione 1 mL de PBS, centrifugue as células de levedura a 1500 x g por 5 min em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa 2x no mesmo tubo.
- Ressuspenda as células em 1 mL de meio YNB-100G e prepare diferentes diluições (1:10, 1:100 e 1:1000) das células. Pegue 200 μL de suspensão de célula gradiente e coloque-a no meio SDA de 10 cm pelo método da placa espiral13. O revestimento é feito usando uma máquina que deposita um volume conhecido de amostra em uma placa de ágar rotativa em uma quantidade cada vez menor na forma de uma espiral de Arquimedes. Cultura durante 24-48 h a 37 °C.
- Calcular a concentração de células em diferentes diluições de acordo com o número de UFC na placa SDA com base num método normalizado13. Conte brevemente as colônias bem separadas em cada placa. Conte as colônias em um octante da borda externa em direção ao centro até que pelo menos 25 colônias sejam observadas. Além disso, conte o restante do arco onde ocorreu a25ª contagem. Calcule a concentração das células dividindo a contagem de colônias pelo volume líquido correspondente à área sobre a qual a contagem de colônias foi obtida13. Ajuste a concentração de células para 1 x 107 células / mL.
- Coloque 100 μL da suspensão celular em YNB-100G em uma placa de 96 poços e incube a 37 ° C por 2 h agitando a 200 rpm.
- Retire cuidadosamente o sobrenadante, lave 2x com PBS e retire as células de levedura flutuantes. O biofilme de Candida se forma na parte inferior da placa de 96 poços.
7. Ensaio de formação de hifas
NOTA: Apenas Candida que pode formar hifas (como Candida albicans) pode ser induzida para a formação de hifas. Vá para a etapa 8 para uma caracterização mais aprofundada de Candida que não pode formar hifas (como Candida glabrata).
- Ressuspenda a suspensão de células de levedura na etapa 6.6 e ajuste a concentração celular para 1 x 106 células/mL com meio YNB-100G.
- Para preparar o meio de crescimento completo RPMI 1640, adicione 50 mL de soro fetal bovino (ver Tabela de Materiais) em 450 mL de meio RPMI 1640 (ver Tabela de Materiais) e armazene a 4 ° C para experimentos adicionais.
- Transfira 2 μL de suspensão de células de Candida diluída em 200 μL de meio de crescimento completo RPMI 1640 para uma placa de 96 poços e cultive durante a noite a 37 ° C para permitir a formação de hifas e células de levedura.
8. Teste de esfregaço KOH e ensaio de coloração CFW
- Retire 1 μL de amostras da etapa 3 ou etapa 6 ou etapa 7 usando um laço moldado com precisão (consulte a Tabela de Materiais) e espalhe uma área de 1 cm x 1 cm nas lâminas de vidro. Espere secar em temperatura ambiente.
- Para fazer uma solução de KOH a 10%, pesar 10 g de pó de KOH (ver Tabela de Materiais) e dissolva-o em 100 mL de água bidestilada
- Aqueça levemente a lâmina com uma lâmpada de álcool até que a amostra se dissolva. Pintar as lâminas preparadas na etapa 8.1 com 10% de KOH (etapa 8.2) e cobrir com uma lamínula. Pressione levemente a lamínula para tornar a amostra transparente.
- Visualize as hifas e as células de levedura ao microscópio.
- Manchar as lâminas preparadas na etapa 8.1 com uma gota de CFW (ver Tabela de Materiais), cobrir com uma lamínula e aguardar 1 min.
- Visualize as hifas usando um microscópio de fluorescência nas ampliações de 100x e 200x. CFW é excitado em 355 nm e detectado em 300-440 nm. Fotografe as imagens sob o tempo de exposição. Repita 3x para evitar resultados falsos positivos.
9. Teste de suscetibilidade antifúngica
NOTA: Este teste é realizado de acordo com as instruções do fabricante para o Kit de Suscetibilidade a Fungos Semelhantes a Leveduras (Microdiluição; consulte a Tabela de Materiais).
- Prepare colônias de Candida (etapa 4) com menos de 4 dias de idade com a ampola de NaCl a 0,85% (consulte a Tabela de Materiais) e adquira a suspensão com turbidez equivalente a 2 McFarland. Determine a turbidez de acordo com o Kit de Padrões McFarland (consulte a Tabela de Materiais). Use a suspensão de Candida preparada instantaneamente.
- Pipetar 135 μL de meio ATB F2 no kit contendo 3 x 104 células de levedura/ml em cada cúpula da tira de ensaio e colocar a tampa. Coloque a tira de teste em um recipiente lacrado. Cultura durante 24 h a 35 °C.
- Observe o crescimento da Candida com interpretação visual (consulte o manual do usuário). Para o valor de referência (intervalo de referência), consulte o manual do usuário. Verifique se o orifício de controle está crescendo adequadamente. Se o crescimento do orifício de controle for insuficiente ou não crescer, os resultados não podem ser lidos e precisam de mais 24 horas de cultivo.
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Representative Results
Neste estudo, 12 pacientes com SSp foram selecionados como pacientes representativos e triados para infecção oral por Candida (Tabela 1). Entre esses pacientes, alguns pacientes exibiram lesões orais típicas de infecção por Candida , incluindo queilite angular (caracterizada por rachaduras nos cantos da boca, descamação e hiperemia, Figura 1A), edema vermelho vivo na mucosa gengival, pseudomembrana fibrosa branco-amarelada (Figura 1B), atrofia das papilas linguais e mucosa dorsal da língua vermelha brilhante (Figura 1C).
Dentre esses 12 pacientes envolvidos no presente estudo, 8 deles apresentaram infecção oral por Candida, o que foi confirmado pelo crescimento de colônias de Candida nas placas SDA (Figura 2A-C e Figura Suplementar 1). O ágar diagnóstico mostrou que as infecções orais por Candida de Candida albicans, Candida krusei e Candida glabrata existem entre esses pacientes com SSp (Figura 2D-F, Figura Suplementar 2A, B). Em alguns casos, mais de uma espécie de Candida foi detectada, como uma infecção combinada com Candida albicans e Candida krusei, bem como uma infecção combinada com Candida albicans e Candida glabrata (Figura 2D, Figura Suplementar 2A, B).
O teste de esfregaço de KOH e o subsequente ensaio de coloração CFW, utilizando amostras de saliva do paciente ou swab da mucosa oral, podem determinar rapidamente se o paciente tem infecção oral por Candida. Neste estudo, a presença de hifas foi observada em ambas as amostras orais de pacientes com SSp (Figura 3A,B). O achado foi validado pelo ensaio de coloração CFW, que exibiu coloração fluorescente positiva das hifas (Figura 3C,D). Além disso, as hifas de um paciente com SSP infectado com Candida albicans oral foram induzíveis através do ensaio de formação de hifas (Figura 4A), e as hifas induzidas foram observadas ao microscópio de fluorescência no ensaio de coloração CFW (Figura 4D). Além disso, o teste de esfregaço de KOH e o ensaio de coloração CFW indicaram esporos fúngicos positivos e pseudo-hifa de um paciente com SSP com infecção por Candida krusei ( Figura 4B , E ) e esporos de fungos de um paciente com SS com infecção por Candida glabrata ( Figura 4C , F ), após a formação do biofilme de Candida.
O teste de suscetibilidade antifúngica é crucial para orientar o manejo clínico de infecções orais por Candida em pacientes com SSp. Aqui, três pacientes representativos foram testados quanto à suscetibilidade antifúngica a cinco agentes comumente prescritos: Fluconazol, Itraconazol, Anfotericina B, Voriconazol e 5-Fluconazol. Os resultados foram interpretados de acordo com as diretrizes do fabricante. Os pacientes 1 e 3 da SSp apresentaram sensibilidade a todos os antifúngicos testados (Tabela 1)14,15. O paciente 2 com SSp demonstrou uma resposta intermediária dose-dependente ao Fluconazol e Voriconazol, uma sensibilidade dose-dependente, intermediária a resistente ao Itraconazol, resistência ao 5-fluconazol e sensibilidade ao tratamento com Anfotericina B (Tabela 2)14,15.
Figura 1: Manifestações orais representativas da infecção oral por Candida . (A) Queilite angular (rhazades nos cantos da boca, descamação e hiperemia). (B) Uma lesão eritematosa com edema na mucosa gengival alveolar, com uma pseudomembrana fibrosa branco-amarelada. (C) Dorso atrófico das papilas linguais com lesão de eritema atrófico disperso e irregular, avermelhado e circunscrito. Setas pretas apontam para as lesões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ágar Sabouraud dextrose (SDA) e identificação da cepa de Candida . (AC) A cultura SDA de amostras orais (saliva, enxaguatório bucal PBS ou troca de mucosa oral) de 3 pacientes representativos de SS com infecção por Candida . O ensaio de identificação da cepa de Candida usando um ágar diagnóstico de Candida mostra pacientes com SSP com infecções orais por (D) Candida albicans mais Candida Krusei , (E) infecção por Candida albicans e (F) infecção por Candida glabrata . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Teste instantâneo de esfregaço de hidróxido de potássio (KOH) e ensaio de coloração branca de calcofluor (CFW). O ensaio foi realizado usando amostras orais (saliva, enxaguatório bucal PBS ou troca de mucosa oral) de 2 pacientes representativos de SSp. Teste de esfregaço de KOH usando a amostra oral de (A) pSS paciente 1 e (B) pSS paciente 2. Setas pretas e ocas apontam para as hifas. Ensaio de coloração CFW usando a amostra oral do paciente (C) pSS 1 e (D) pSS paciente 2. Setas ocas brancas apontam para as hifas e esporos de fungos. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 4: Teste de esfregaço de hidróxido de potássio (KOH), ensaio de coloração branca de calcofluor (CFW) de amostras após a cultura. Teste de esfregaço de KOH usando saliva de paciente com SSp com (A) infecção por Candida albicans , (B) paciente com SSp com infecção por Candida krusei e (C) paciente com SSp com infecção por Candida glabrata . Ensaio de coloração CFW de hifas induzidas de paciente com SSP com infecção por (D) Candida albicans , esporos de fungos e pseudo-hifas de (E) paciente com SSP com infecção por Candida krusei e esporos de fungos de (F) paciente com SSP com infecção por Candida glabrata . Setas ocas brancas apontam para as hifas; setas sólidas brancas apontam para a pseudo-hifa. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura suplementar 1: Cultura representativa de ágar dextrose Sabouraud (SDA) usando amostras orais de pacientes com SSP (saliva, enxaguatório bucal PBS ou troca de mucosa oral). (AC) Cultura SDA de Candida usando amostras orais de 3 pacientes representativos de SSP. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 2: Identificação da cepa de Candida . A identificação da possível Candida infectada dos 12 pacientes com SSP usando um ágar diagnóstico de Candida . (A) A identificação da cepa de Candida usando amostras orais de pacientes com SSP 1-6. Paciente 1 com SSP: Candida albicans, 2: Candida albicans, 3: Candida albicans e Candida krusei, 4: Candida albicans, 5: Candida albicans e Candida glabrata, 6: sem infecção oral por Candida . (B) A identificação da cepa de Candida usando amostras orais de pacientes com SSp 7-12. Paciente SS 7: Candida albicans, 8: Candida albicans e Candida glabrata, 9: sem infecção oral por Candida , 10: Candida albicans, 11: sem infecção oral por Candida , 12: sem infecção oral por Candida . Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela 1: Informações dos pacientes com síndrome de Sjögren primária. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Resultados dos testes de sensibilidade aos antifúngicos dos pacientes14,15. Abreviaturas: S = sensível, I = intermediário, R = resistente, SDD = sensível dependente da dose, C = concentração. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
No presente manuscrito, fornecemos uma série de métodos sistemáticos, simples e viáveis para detectar infecções orais por Candida , identificar cepas de Candida e testar a suscetibilidade antifúngica de medicamentos comumente usados em pacientes com SSP.
Em ambientes práticos, nem todos os métodos apresentados neste manuscrito são necessários. O(s) método(s) de detecção oral de Candida pode(m) ser escolhido(s) com base na finalidade específica. Os testes de esfregaço de KOH e os ensaios de coloração CFW, usando amostras sem cultura, podem determinar rápida e preliminarmente a presença de infecção oral por Candida em pacientes com SSp. No entanto, esses métodos têm uma taxa relativamente alta de falso-negativos16. Se for difícil confirmar a infecção, a cultura de Candida é essencial. A resistência aos medicamentos é um fator que deve ser considerado durante o tratamento; algumas cepas de Candida são naturalmente resistentes a alguns medicamentos antifúngicos, por exemplo, Candida krusei é naturalmente resistente ao tratamento com Fluconazol17. Portanto, às vezes, a cepa de Candida precisa ser identificada. Nesse caso, a cepa de Candida pode ser identificada por um ágar diagnóstico de Candida . Atualmente, a Candida resistente a medicamentos está recebendo cada vez mais atenção18. O teste de suscetibilidade antifúngica pode orientar o tratamento e, assim, evitar ao máximo a resistência aos medicamentos durante o tratamento. O ensaio de formação de biofilme de Candida e o ensaio de formação de hifas são adequados para pesquisas relacionadas à infecção oral por Candida .
A infecção oral por Candida é uma das complicações mais frequentes em pacientes comSSP4, impactando significativamente sua qualidade de vida devido à variedade de sintomas que causa. Notavelmente, os pacientes com SSp são altamente suscetíveis a essa infecção, e o tratamento eficaz geralmente requer terapia sistêmica e cooperação do paciente19. Consequentemente, as infecções orais por Candida são frequentemente recorrentes nessa população. É crucial identificar a candidíase oral e realizar testes de suscetibilidade antifúngica para orientar o tratamento. Dentre os métodos detalhados neste manuscrito, a coleta de amostras orais para detecção de Candida e posterior cultura são as etapas mais críticas.
Além disso, a Candida que tem formação de hifas (como Candida albicans) pode ser facilmente detectada pelo teste rápido de esfregaço KOH e ensaio de coloração CFW usando amostras coletadas sem cultura. Embora a maioria das infecções orais por Candida possa ser detectada e as cepas de Candida possam ser identificadas através dos métodos apresentados neste manuscrito, algumas cepas de Candida não podem ser identificadas de outras especificamente apenas por métodos como cultura SDA, cultura de ágar diagnóstico de Candida, ensaio de formação de biofilme de Candida e ensaio de formação de hifas. Além disso, algumas cepas de Candida não podem ser induzidas a produzir hifas, como Candida glabrata. A identificação de espécies baseada em rt-PCR de 18s rDNA pode identificar com precisão as espécies de Candida com base em sua semelhança genética 10,20,21. Se necessário, a identificação de espécies baseada em rt-pcr de 18s rDNA pode ser utilizada, por exemplo, em pesquisas sobre infecção oral por Candida em pacientes com SSP.
Por via intraoral, a manifestação da infecção por Candida pode se apresentar como lesões eritematosas da mucosa, estomatite protética e fissura da língua. Na área perioral, a colonização de Candida causa um aspecto seco, rachado e eritematoso7. A prevalência relatada de candidíase oral clínica varia amplamente em pacientes com SS, variando de 0% a 80%. As possíveis razões para a grande variação da candidíase oral incluem a falta de sintomatologia clara e, mais importante, os diferentes critérios utilizados para o diagnóstico de candidíase oral na literatura 8,9,12. Além disso, pacientes com infecção por Candida são relatados como tendo um risco maior de SS, e a infecção por Candida pode atuar como um sinal precoce de SSsubsequente 22. O diagnóstico precoce da SSp é crucial para o tratamento e o estudo anatomopatológico. Portanto, é imperativo fornecer métodos universais, convenientes e viáveis para identificar a infecção oral por Candida em pacientes com SSp.
Embora a disbiose no microbioma intestinal, oral e vaginal seja frequente em pacientes com SSp, as amostras orais demonstram a maior extensão da variação microbiana1. Em condições normais, o fluxo médio diário de saliva total é de 1 a 1,5 L2. Até 99% da saliva é composta de água e o 1% restante é composto de proteínas e íons. A saliva desempenha um papel importante na determinação da composição e atividade da microbiota oral por vários motivos3. A saliva não apenas limpa continuamente os dentes, desempenhando funções cruciais de higiene bucal em condições saudáveis, mas também forma uma película condicionante nas superfícies orais. Este filme fornece receptores para a fixação de bactérias, auxilia no crescimento de bactérias, fornecendo-lhes nutrientes de glicoproteínas e mantém um pH adequado para o crescimento bacteriano. Além disso, a saliva contém fatores antimicrobianos e anti-candida que regulam e moldam a microbiota. Além disso, a saliva contém fatores antimicrobianos e anticandidáticos, como adrenomedulina, estaterina, histatinas, α-defensinas, lisozima, histatinas, lactoferrina e calprotectina, que regulam e moldam a microbiota4. A SSp é caracterizada por desregulação autoimune e hipofunção glandular. A hipossalivação, uma redução no fluxo salivar, é um dos sintomas mais prevalentes da SSp. A diminuição dos níveis de pH salivar e do fluxo são fatores de risco significativos para infecções orais por Candida 5. Além disso, as infecções por Candida são relatadas como a segunda complicação orofacial mais comum associada à SS6. Os autores sugerem que o aumento das infecções por Candida em pacientes com SSp pode estar ligado não apenas à diminuição da produção de saliva, mas também à desregulação imunológica inerente à SS.
Para concluir, métodos práticos e reprodutíveis para infecção oral por Candida e testes de suscetibilidade a antifúngicos introduzidos neste manuscrito são promissores para melhorar a identificação clínica e o tratamento de infecções por Candida . Além disso, esses procedimentos padronizados podem minimizar inconsistências em pesquisas relacionadas à candidíase oral.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82201084), Fundação de Ciências de Pós-Doutorado da China (2022M722232), Fundação de Pesquisa de Pós-Doutorado de Pequim (2023-ZZ-020), Projeto Miaopu do Hospital Tiantan de Pequim, Capital Medical University (2023MP10) e Fundo Geral de Pesquisa, Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong (27111820 e 17116521).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filter | MERCK | SLGV004SL | |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | axygen | MCT-150-C-S | |
| 10 cm Microbiological Culture Dishes | Jet Bio-Filtration Co. Ltd | TCD000100 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Jet Bio-Filtration Co., Ltd | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430290 | |
| 96-well Microplates | Corning | 3599 | |
| API 0.85% NaCl ampule | BIOMERIEUX | 20070 | |
| Calcofluor White Stain | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| CHROMagar Candida | CHROMagar | P002860 | Candida diagnostic agar |
| D(+)-Glucose Monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010518 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26170035 | |
| McFarland Standards Kit | BIOMERIEUX | 70900 | |
| Nunc precision molded loops | ThermoFisher Scientific | 254399 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | C10010500BT | |
| Potassium Hydroxide | Aladdin | P112284-500g | |
| PowerSoil DNA Isolation Kit | MO BIO | 12888-50 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875119 | |
| Sabourand's Agar Medium | Solarbio | S9710 | |
| Yeast Nitrogen Base Without Amino acids | Solarbio | Y8040 | |
| Yeast-like Fungal Susceptibility Kit (Microdilution) | BIOMERIEUX | 14204 |
References
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