Overview
يقدم هذا الفيديو طريقة لعزل وزراعة الخلايا الجنينية C. elegans العقيمة في المختبر.
Protocol
1. تفكك الخلايا الجنينية
- إجراء الخطوات التالية من الإجراء في ظل ظروف معقمة باستخدام غطاء محرك السيارة تدفق صفح. في حين أن الحيوانات هي ثوب على لوحات البكتيريا، يغسل والعلاج مع محلول تحلل تحتوي على التبييض ينبغي القضاء على معظم إن لم يكن كل البكتيريا. وبالتالي استخدام غطاء صفح في هذه المرحلة من الإجراء يمنع تلوث جديد من تعليق البيض.
- Resuspend البيض بيليه في 1 مل من 2 ملغ / مل chitinase (الأسهم في البيض العازلة pH 6.5) ونقلها إلى أنبوب جديد معقم مخروطي 15 مل. صخرة أنبوب لمدة 10-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يتغير وقت الحضانة الدقيق وفقا لنضارة الإنزيم ودرجة حرارة الغرفة ، وبالتالي يجب تحديده لكل إعداد. يوصى بالبدء في مراقبة البيض تحت مجهر مقلوب لزراعة الخلايا بعد 10 دقائق من الحضانة. ملاحظة: في تجربتنا، وانخفاض الحموضة يزيد من النشاط الأنزيمي chitinase. لهذا السبب نستخدم البيض العازلة في درجة الحموضة 6.5 لإذابة chitinase (وصفة المذكورة أعلاه، حيث يتم تعديل درجة الحموضة إلى 6.5 باستخدام NaOH).
- عندما يتم هضم ~ 80٪ من قشر البيض عن طريق العلاج chitinase (الأرقام 1 A-B)، بيليه البيض عن طريق الطرد المركزي في 900 × ز (~ 2500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق. باستخدام P1000 pipettor ونصائح معقمة، وإزالة بعناية supernatant وإضافة 3 مل من L-15 المتوسطة.
- نقل البيض إلى لوحة قطرها 6 سم وتفكيك الخلايا بلطف باستخدام حقنة معقمة 10 مل مجهزة إبرة 18 G. مراقبة درجة الانفصال عن طريق وضع قطرة من التعليق في طبق بيتري البلاستيك الطازج ومن خلال عرض تحت المجهر. لا يستنشق الهواء في المحقنة أثناء هذا الإجراء لتجنب إتلاف الخلايا. استمر في الانفصال حتى يتم فصل ~ 80٪ من الخلايا.
- فلتر التعليق باستخدام فلتر ميليبور 5 ميكرومتر معقم. يجب تصفية تعليق الخلايا من أجل إزالة كتل الخلايا والبيض غير المهضوم واليرقات المفقسة. تصفية إضافية 4-5 مل من وسائل الإعلام L-15 الطازجة من خلال مرشح لاستعادة جميع الخلايا. لا تستخدم القوة المفرطة أثناء خطوة الترشيح لتجنب إتلاف الفلتر و/أو الخلايا.
2. زراعة الخلايا
- بيليه الخلايا المفككة عن طريق الطرد المركزي في 900 × ز (~ 2500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق. باستخدام أنبوب P1000 ونصائح عقيمة إزالة بعناية كل supernatant. Resuspend الخلايا بيليه في كامل L-15 المتوسطة ولوحة 1 مل / بئر. تعتمد كمية الوسط المضاف على عدد لوحات 8P المستخدمة ، والتقاء الديدان على اللوحات ، ونوع التجارب التي سيتم إجراؤها على الخلايا. يمكن تحديد كثافة الخلية باستخدام مقياس الدم. لتسجيلات التصحيح المشبك الطلاء كثافة ~ 230،000 الخلايا / سم2 هو الأمثل.
- الحفاظ على لوحة الآبار 24 في حاوية Tupperware البلاستيك التي تحتوي على المناشف الورقية الرطبة لتجنب تبخر الثقافة المتوسطة. تخزين الحاوية في حاضنة رطبة في 20 درجة مئوية والهواء المحيط.
- عادة ما تكون الخلايا جاهزة للتجارب في غضون 24 ساعة عندما يكتمل التمايز المورفولوجي والتعبير عن علامات GFP. يمكن الاحتفاظ بالخلايا في الثقافة لمدة تصل إلى أسبوعين ولكنها عادة ما تكون أكثر صحة حتى 7-9 أيام بعد الطلاء. يجب استبدال الوسيلة مرة واحدة في اليوم للحفاظ على الخلايا السليمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام التي يمكن أن ج. الأجنة elegans قبل وبعد العلاج chitinase. (أ) صورة للبيض قبل التعرض للتشيتيناز. يشير السهم إلى قشر البيض الشفاف وسليم المحيط بالجنين. (ب) البيض المعالج بتشيتيناسي لمدة 10 دقائق. وقد تم هضم قشر البيض ولم تعد مرئية حول الأجنة. تشير الأسهم إلى الأجنة ثلاثية الطيات المنبعثة من قشر البيض. يحيط المربع الأزرق بمجموعة من الخلايا التي لا تزال متصلة ببعضها البعض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
REAGENTS | |||
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
EQUIPMENT | |||
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 22629883 | |
Laminar Flow Hood | |||
Inverted Microscope with x10 objective | |||
Ambient air humidified Incubator |