Microdissectie van de zebravis embryonale oogweefsels

Summary

Dit artikel beschrijft een aanpak voor zebravis netvliezen microdissect met en zonder retinale pigmentepitheel bevestigd, van een tot drie dagen postfertilization embryo's.

Abstract

Zebravis is een populair diermodel voor onderzoek op het oog ontwikkeling als gevolg van de snelle<em> Ex utero</em> Ontwikkeling en een goede vruchtbaarheid. Met 3 dagen na de bevruchting (DPF), zal de larven geven de eerste visuele reactie. Veel genen geïdentificeerd die een behoorlijke eye ontwikkeling controle, maar we zijn verre van een volledig begrip van de onderliggende genetische architectuur. Hele genoom gen expressie profilering is een nuttig hulpmiddel om genetische regelgeving netwerk toe te lichten voor de ogen ontwikkeling. Echter, de geringe omvang van de embryonale oog in zebravissen maakt het een uitdaging om het verkrijgen intact en pure eye weefsels voor expressie analyse. Bijvoorbeeld, de anterior-posterior lengte van het oog tussen dag 2 en 3 is slechts ongeveer 200-300 micrometer, terwijl de diameter van de lens is minder 100 micrometer. Ook de retinale pigment epitheel (RPE) ten grondslag liggen aan het netvlies is gewoon een single-layer epitheel. Terwijl de genexpressie profielen kunnen worden verkregen uit het hele embryo, zij niet nauwkeurig de expressie van deze weefsels. Dus zuiver weefsel moet worden verkregen voor een succesvolle gen expressie profilering van het oog ontwikkeling. Om dit probleem hebben we een aanpak ontwikkeld om intact netvlies en het netvlies met de RPE bevestigd 1-3 DPF, die een belangrijke stadia van het oog van morfogenese te dekken microdissect. Alle procedures kan gedaan worden met fijn pincet en algemene laboratorium levert onder standaard stereomicroscopen. Voor netvlies dissectie, is het single-layer RPE verwijderd en afgepeld door borstelen actie en de preferentiële hechting van de RPE overblijfselen aan het oppervlak van de cultuur plaat voor dissectie. Voor de RPE-aangesloten netvlies dissectie, is de hechting van RPE bij de dissectie plaat verwijderd voordat de dissectie, zodat de RPE volledig kan worden geconserveerd met het netvlies. Een zorgvuldige tillen actie van dit weefsel kan efficiënt scheiden van de vermoedelijke vaatvlies en de sclera. De lens kan worden verwijderd in beide gevallen door een chemisch geëtst wolfraam naald. Kortom, onze aanpak krijgen intact oog weefsels en is met succes gebruikt om weefsel-specifieke expressie profielen van zebravis netvlies studie^{1, 2} En retinale pigment epitheel³.

Protocol

Deel 1: Voorbereidingen voor het microdissectie Oplossingen E3 medium 4 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 en 0,33 mM MgSO 4). Ringer-oplossing 1, 5 (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH7.2), filter gesteriliseerd. 5N NaOH. Chemisch etsen van wolfraam naalden Secure een klein bekerglas met 5N NaOH op een petrischaaltje met klei. Bevesti…

Discussion

Microdissectie van de zebravis oogweefsels effectief kan krijgen intact netvlies en de RPE-aangesloten netvlies. Dit helpt aanzienlijk expressie studies met betrekking tot een specifieke oogweefsel (dat wil zeggen het netvlies of RPE). In feite hebben we met succes gebruik gemaakt van deze procedures om RNA-expressie profielen te verkrijgen van de hele retina ¹ en RPE ^3. Het nut van deze profielen wordt sterk ondersteund door onze recente identificatie van paden en gen-families die worden verstoord…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Cordless pestle motor		VWR	47747-370
DC power supply		Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)		VWR	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox		World Precision Instruments	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox		Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm		BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope		Olympus	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone		Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate		Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL		Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter		World Precision Instruments	TGW1510
Wooden Applicator		Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.