Микродиссекции данио рерио эмбриональных тканей глаз
Summary
В этой статье описывается подход к microdissect данио сетчатки и без пигментного эпителия сетчатки связаны, от одного до трех дней эмбрионы функции организма крыс.
Abstract
Данио рерио является популярная модель животного для исследования на развитие глаза из-за его быстрого<em> Ех внутриутробно</em> Разработка и хорошей плодовитости. К 3 дней после оплодотворения (DPF), личинки покажет первый визуальный ответ. Многие гены были идентифицированы для контроля правильного развития глаза, но мы еще далеки от полного понимания основных генетических архитектуры. Всего генома экспрессии генов профилирования является полезным инструментом для выяснения генетических регулирующей сети для развития глаза. Тем не менее, небольшой размер глаз в эмбриональном данио делает его сложным для получения неповрежденной и чистой ткани глаза для выражения анализа. Например, передне-задней длина глаз между днем 2 и 3 только около 200-300 мкм, а диаметр объектива меньше 100 мкм. Кроме того, пигментный эпителий сетчатки (ПЭС), лежащие в основе сетчатка состоит всего из одного слоя эпителия. Хотя профили экспрессии генов могут быть получены из целого эмбриона, они не точно представляют выражение этих тканей. Поэтому чистые ткани должны быть получены для успешного профилирования экспрессии генов в развитии глаза. Для решения этой проблемы, мы разработали подход к microdissect нетронутыми сетчатки и сетчатки с НПП прилагается от 1-3 DPF, которые охватывают основные этапы глаз морфогенеза. Все процедуры можно сделать с помощью тонкой щипцов и общего назначения лаборатории при стандартных стереомикроскопов. Для сетчатки вскрытия, однослойные НПП удаляется и снимают кистью действия и льготным приверженность НПП остатки на поверхность культуры пластина для вскрытия. Для РПЭ-прилагается сетчатки рассечение, присоединение к НПП вскрытии пластины удаляется до вскрытия, так что РПЭ может быть полностью сохранившийся с сетчаткой. Осторожны действия снятие этой ткани могут эффективно отдельных предполагаемого сосудистой оболочки и склеры. Линзы могут быть удалены в обоих случаях химическим травлением вольфрамовой иглы. Короче говоря, наш подход может получить здоровых тканей глаза и была успешно использована для изучения тканеспецифические профили экспрессии данио сетчатки<sup> 1, 2</sup> И пигментного эпителия сетчатки<sup> 3</sup>.
Protocol
Discussion
Микродиссекция тканей данио глаз может эффективно получить нетронутыми сетчатки и РПЭ-прилагается сетчатки. Это существенно помогает выражение исследований, касающихся конкретных тканей глаза (например, сетчатки или РПЭ). На самом деле, мы успешно использовал эти процедуры, чтобы пол…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается запуск фонд от Отделения биологических наук Университета Пердью.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cordless pestle motor | VWR | 47747-370 | ||
| DC power supply | Lascar | PSU130 | Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization. | |
| Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free) | VWR | 47747-366 | These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis. | |
| Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox | World Precision Instruments | 500341 | Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time. | |
| Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox | Fine Science Tools | 11252-00 | Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time. | |
| Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm | BD Biosciences | 351007 | These plates are used as dissection plates. | |
| Olympus SZX16 Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed. | |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary | |
| Thermo plate | Tokai Hit | MATS-U55SZX2B | This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success. | |
| Trizol, 100 mL | Invitrogen | 15596-026 | ||
| tungsten wire, 0.015 inch diameter | World Precision Instruments | TGW1510 | ||
| Wooden Applicator | Puritan | 807 | This is used for holding the chemically-etched tungsten needle. |
Riferimenti
- Leung, Y. F., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina. Zebrafish. 2, 269-283 (2005).
- Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).
- Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish : a practical approach. , (2002).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).
