子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した
Summary
子宮内エレクトロポレーションでは、生体内で神経前駆細胞をトランスフェクションするための貴重な方法です。電極の配置とエレクトロの発達タイムポイントに応じて、皮質細胞の特定のサブセットを対象とすることができます。標的細胞は、その後、in vivoまたは遺伝的改変の影響についてin vitroで分析することができます。
Abstract
プライマリーニューロン培養の in vitro研究では神経突起伸長の定量分析が可能になります。神経突起の伸長にどのように影響する遺伝的変化を研究するために、shRNAまたはcDNA構築物は、化学物質のトランスフェクションまたはウイルスの伝達を介して一次ニューロンに導入することができる。しかし、一次皮質細胞と、細胞の種類（別の層からグルタミン酸作動性ニューロン、抑制性神経細胞、グリア細胞）の異種プールはこれらのメソッドを使用してトランスフェクトされる。胚性齧歯類の大脳皮質でのDNA構築物を導入するために子宮内エレクトロポレーションでの使用は、標的とする細胞の特定のサブセットを可能にする：初期胚大脳皮質のエレクトロポレーションは、大脳皮質の深い層をターゲットにしながら、後期胚の時点においてでエレクトロポレーションはより多くの表面的な層をターゲットにしています。さらに、皮質の背内側対腹側外側の領域のターゲット内の個々の胚の結果の頭部間の電極の差動配置。エレクトロポレーションに続いて、トランスフェクションされた細胞は、外解剖解離、および神経突起伸長の定量分析のためのin vitroでめっきすることができる。ここでは、定量的に皮質細胞のサブセットで、神経突起の伸長を測定するためのステップバイステップの方法を提供します。
子宮内エレクトロポレーションのための基本的なプロトコルはKriegsteinラボ1、2から二つのJoveの記事で詳細に説明されています。我々は、神経突起伸長における遺伝子機能の研究に子宮内エレクトロポレーションに適用される我々のプロトコルの説明に続いて最も重要な詳細、に焦点を当て、 子宮内エレクトロポレーションのために我々のプロトコルの概要について説明します。
Protocol
Discussion
プライマリーニューロン培養の in vitro研究では神経突起伸長の定量分析を可能にする。神経突起伸長、shRNAまたはmisexpression構造にどのように影響する遺伝的変化を研究するために化学物質のトランスフェクションまたはウイルスの伝達を介して一次ニューロンに導入することができる。しかし、一次皮質細胞と、細胞の種類（別の層からグルタミン酸作動性ニューロン、抑制性?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らはこの手法に関する有用な議論をジョセフLoTurcoとデニスSelkoeに感謝します。著者らはこの研究をサポートするため、アメリカの健康支援基金のドナーに感謝。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cortical Neuron Preparation | ||||
| Dissection Media: | ||||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | Gibco | 14185-052 | ||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | Gibco | 14065-056 | ||
| 1M HEPES pH 7.4 | Gibco | 15630-080 | ||
| Dishes and Vials: | ||||
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisherbrand | 08-757-12 | ||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351007 | ||
| 15 mL conical vial | Sarstedt | 62-547-205 | ||
| 50 mL conical vial | Sarstedt | 62-554-205 | ||
| Dissection Tools: | ||||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | ||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | ||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | ||
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Miscellaneous: | ||||
| .25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | ||
| Hand-Held Tally Counter | Sigma | Z169021 | ||
| Plating Medium: | ||||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
| Growth Medium: | ||||
| NEUROBASAL Medium | Gibco | 21103-049 | ||
| B-27 Serum-Free Supplement | Gibco | 17504-044 | ||
| GlutaMAX -I Supplement | Gibco | 35050-061 | ||
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15750-060 | ||
| Immunostaining: | ||||
| Fixative, Washes, and Blocking Buffer: | ||||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
| Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | ||
| Antibodies: | ||||
| beta-III tubulin antibody | Chemicon | MAB1637 | ||
| MAP2 antibody | Chemicon | AB15452 | ||
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson Immuno | 715-166-151 | ||
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson Immuno | 703-226-155 | ||
| DAPI | Gibco | D3571 | ||
| Slide Preparation: | ||||
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | ||
| Fluorescent Mounting Media | KPL | 71-00-16 | ||
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | ||
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | ||
| Electroporation: | ||||
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | ||
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | ||
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | ||
| Picospritzer III | Parker | |||
| BTX square wave electroporator | Fisher | BTXECM830 | ||
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
Riferimenti
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- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
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- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
