Summary

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Published: October 08, 2010
doi:

Summary

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

Abstract

Primer nöronal kültürlerin di vitro çalışmada, kantitatif analizler için neurite akıbet sağlar . Genetik değişiklikler nöronal sürecin sonucudur, shRNA veya cDNA yapıları kimyasal transfeksiyon veya viral transdüksiyon yoluyla birincil nöron içine sokulabilir nasıl etkilediğini araştırmak için. Ancak, birincil kortikal hücreler ile, hücre tipleri (farklı katmanları, inhibitör nöronlar, glial hücreler glutamaterjik nöronlar) heterojen bir havuz, bu yöntemleri kullanarak transfekte vardır. Utero elektroporasyon embriyonik kemirgen korteks DNA yapıları tanıtmak için kullanılması hedeflenen hücreleri belirli altkümelerini sağlar: elektroporasyon korteksin erken embriyonik korteks hedefleri derin katmanları, geç embriyonik timepoints az elektroporasyon daha yüzeysel katmanları hedefleri. Ayrıca, dorsal karşı ventral-lateral medial korteks bölgelerinin hedef bireysel embriyolar sonuçları başkanları arasında elektrot diferansiyel yerleştirme. Elektroporasyon ardından, transfekte hücreler, disseke ayrışmış, ve neurite akıbet kantitatif analiz için in vitro kaplı olabilir. Burada, kortikal hücrelerin altkümelerini nöronal sürecin sonucudur kantitatif ölçmek için bir adım-adım yöntemi sağlar.

Utero elektroporasyon protokolün temel Kriegstein laboratuar 1, 2, diğer iki vallahi makalelerde detaylı olarak tarif edilmiştir . Biz en önemli ayrıntıları odaklanarak nöronal sürecin sonucudur gen fonksiyonu çalışmaya utero elektroporasyon geçerlidir protokolün bir açıklama ile takip utero elektroporasyon için protokol genel bir bakış, sağlayacaktır.

Protocol

Utero elektroporasyon protokolün temel Kriegstein laboratuar 1, 2 vallahi başka bir makalede ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu teknik ilk Osumi laboratuar 3 açıklanan ve bizim protokol LoTurco laboratuar 4 geliştirilen bir dayanmaktadır. Biz protokol nöronal sürecin sonucudur gen fonksiyonu çalışma utero elektroporasyon geçerli olduğu bir açıklama ile takip en önemli ayrıntıları odaklanarak sıçan embriyoların utero elektroporasyon …

Discussion

Primer nöronal kültürlerin in vitro çalışmada neurite akıbet kantitatif analizler için izin verir . Genetik değişiklikler nöronal sürecin sonucudur nasıl etkilediğini araştırmak için, shRNA ya da misexpression yapıları kimyasal transfeksiyon veya viral transdüksiyon yoluyla birincil nöron içine sokulabilir. Ancak, birincil kortikal hücreler ile, hücre tipleri (farklı katmanları, inhibitör nöronlar, glial hücreler glutamaterjik nöronlar) heterojen bir havuz, bu yöntemleri kullanara…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, yararlı tartışmalar için bu tekniği Joseph LoTurco ve Dennis Selkoe teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar, bu araştırma desteği için, Amerikan Sağlık Yardım Vakfı bağışçılar teşekkür ederim.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
Cortical Neuron Preparation        
Dissection Media:        
10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free)   Gibco 14185-052  
10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 )   Gibco 14065-056  
1M HEPES pH 7.4   Gibco 15630-080  
Dishes and Vials:        
100 x 15 mm Petri Dishes Fisherbrand 08-757-12  
60 x 15 mm Petri Dishes   BD Falcon 351007  
15 mL conical vial   Sarstedt 62-547-205  
50 mL conical vial   Sarstedt 62-554-205  
Dissection Tools:        
Scissors   Fine Science Tools 91402-12  
Standard Forceps Fine Science Tools 11000-12  
Curved Forceps   Fine Science Tools 11273-20  
Fine Forceps   Fine Science Tools 11255-20  
Vannas spring scissors   Fine Science Tools 15000-00  
Miscellaneous:        
.25% Trypsin-EDTA   Gibco 25200  
Reichert Bright-Line Hemacytometer   Hausser Scientific 1490  
Hand-Held Tally Counter   Sigma Z169021  
Plating Medium:        
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM)   Gibco 11960-051  
Fetal Bovine Serum   Sigma F4135  
Penicillin-Streptomycin   Gibco 15140  
L-glutamine   Gibco 25030  
Growth Medium:        
NEUROBASAL Medium   Gibco 21103-049  
B-27 Serum-Free Supplement   Gibco 17504-044  
GlutaMAX -I Supplement   Gibco 35050-061  
Gentamicin Reagent Solution   Gibco 15750-060  
Immunostaining:        
Fixative, Washes, and Blocking Buffer:        
Paraformaldehyde   Sigma P6148  
Phosphate Buffered Saline   Sigma P4417  
Triton X-100   Sigma T9284  
Donkey Serum   Jackson Immuno 017-000-121  
Antibodies:        
beta-III tubulin antibody   Chemicon MAB1637  
MAP2 antibody   Chemicon AB15452  
Donkey Cy3 anti-mouse   Jackson Immuno 715-166-151  
Donkey Cy2 anti-chicken   Jackson Immuno 703-226-155  
DAPI   Gibco D3571  
Slide Preparation:        
CC2 Coated Two-Chamber Slides   Lab-Tek 154852  
Fluorescent Mounting Media   KPL 71-00-16  
24 x 60 mm Micro Cover Glasses   VWR 48393-106  
Clear nail polish   Electron Microscopy Sciences 72180  
Electroporation:        
Ketamine   Henry Schein 995-2949  
Xylazine   Henry Schein 4015809TV  
buprenorphine   Henry Schein 1118217  
Picospritzer III   Parker    
BTX square wave electroporator   Fisher BTXECM830  
Tweezertrodes, 7 mm, platinum   Harvard Apparatus 450488  

Riferimenti

  1. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
  2. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
  3. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
  4. Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
  5. Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
  6. Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
  7. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
  8. Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
  9. Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).

Play Video

Citazione di questo articolo
Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103, doi:10.3791/2103 (2010).

View Video