Summary

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

Published: October 08, 2010
doi:

Summary

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

Abstract

기본의 연결을 문화의 체외 연구에서 neurite 가지의 양적 분석을 허용합니다. 유전자 변경은 프로세스의 연결 가지, shRNA 또는 cDNA 구조는 화학 transfection 또는 바이러스성 전달을 통해 기본 뉴런에 도입 수있는 영향을 미치는지 연구하기 위해. 그러나, 기본 대뇌 피질의 세포와 세포 유형 (다른 레이어, 억제 신경, glial 세포에서 glutamatergic 뉴런)의 이질적인 수영장은 이러한 방법을 사용 transfected 있습니다. 배아 쥐 대뇌 피질의 DNA 구조를 소개 utero의 electroporation에의 사용 대상으로 세포의 특정 하위 집합을 허용 : 피질의 초기 배아 피질 대상 깊은 레이어 electroporation은 늦은 배아 timepoints에 electroporation은 더 많은 외면적인 레이어를 대상으로하면서. 또한, 피질의 지느러미 – 중간 대 복부 – 가로 영역의 대상에서 개별 배아 결과의 머리를 통해 전극의 차등 배치. electroporation 다음, transfected 세포는 밖으로 해부 dissociated와 neurite 가지의 정량 분석을 위해 체외에서 도금 수 있습니다. 여기, 우리는 양적 대뇌 피질 세포의 하위 집합에의 연결 프로세스 가지를 측정하기위한 단계별 방법을 제공합니다.

utero의 electroporation에 대한 기본적인 프로토콜은 Kriegstein 연구실 1, 2에서 두 개의 다른 조브 기사에 자세히 설명되어있다. 우리의 연결 프로세스 가지의 유전자 기능 연구에 utero의 electroporation에 적용의 프로토콜에 대한 설명 다음에 가장 중요한 세부 사항에 초점을 utero의 electroporation에 우리의 프로토콜의 개요를, 제공할 것입니다.

Protocol

utero의 electroporation에 대한 기본적인 프로토콜은 Kriegstein 연구실 1, 2에서 다른 조브 문서에서 자세히 설명되었습니다. 이 기법은 원래 오스미 연구실 3 설명한 및 프로토콜 LoTurco 실험실 4 개발 하나를 발견을 기반으로합니다. 우리의 연결 프로세스 가지의 유전자 기능 연구에 utero의 electroporation에 적용되는 우리의 프로토콜에 대한 설명 다음에 가장 중요한 세…

Discussion

기본의 연결을 문화의 체외 연구에서 neurite 가지의 양적 분석을 위해 수 있습니다. 유전자 변경은 프로세스의 연결을 가지 영향을 미치는지 연구하기 위해, shRNA 또는 misexpression 구조는 화학 transfection 또는 바이러스성 전달을 통해 기본 뉴런에 소개하실 수 있습니다. 그러나, 기본 대뇌 피질의 세포와 세포 유형 (다른 레이어, 억제 신경, glial 세포에서 glutamatergic 뉴런)의 이질적인 수영장은 ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는이 기술에 대한 유용한 토론 요셉 LoTurco과 데니스 Selkoe 감사하고 싶습니다. 저자는이 연구의 지원, 미국의 건강 보조 재단의 기부자 감사합니다.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
Cortical Neuron Preparation        
Dissection Media:        
10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free)   Gibco 14185-052  
10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 )   Gibco 14065-056  
1M HEPES pH 7.4   Gibco 15630-080  
Dishes and Vials:        
100 x 15 mm Petri Dishes Fisherbrand 08-757-12  
60 x 15 mm Petri Dishes   BD Falcon 351007  
15 mL conical vial   Sarstedt 62-547-205  
50 mL conical vial   Sarstedt 62-554-205  
Dissection Tools:        
Scissors   Fine Science Tools 91402-12  
Standard Forceps Fine Science Tools 11000-12  
Curved Forceps   Fine Science Tools 11273-20  
Fine Forceps   Fine Science Tools 11255-20  
Vannas spring scissors   Fine Science Tools 15000-00  
Miscellaneous:        
.25% Trypsin-EDTA   Gibco 25200  
Reichert Bright-Line Hemacytometer   Hausser Scientific 1490  
Hand-Held Tally Counter   Sigma Z169021  
Plating Medium:        
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM)   Gibco 11960-051  
Fetal Bovine Serum   Sigma F4135  
Penicillin-Streptomycin   Gibco 15140  
L-glutamine   Gibco 25030  
Growth Medium:        
NEUROBASAL Medium   Gibco 21103-049  
B-27 Serum-Free Supplement   Gibco 17504-044  
GlutaMAX -I Supplement   Gibco 35050-061  
Gentamicin Reagent Solution   Gibco 15750-060  
Immunostaining:        
Fixative, Washes, and Blocking Buffer:        
Paraformaldehyde   Sigma P6148  
Phosphate Buffered Saline   Sigma P4417  
Triton X-100   Sigma T9284  
Donkey Serum   Jackson Immuno 017-000-121  
Antibodies:        
beta-III tubulin antibody   Chemicon MAB1637  
MAP2 antibody   Chemicon AB15452  
Donkey Cy3 anti-mouse   Jackson Immuno 715-166-151  
Donkey Cy2 anti-chicken   Jackson Immuno 703-226-155  
DAPI   Gibco D3571  
Slide Preparation:        
CC2 Coated Two-Chamber Slides   Lab-Tek 154852  
Fluorescent Mounting Media   KPL 71-00-16  
24 x 60 mm Micro Cover Glasses   VWR 48393-106  
Clear nail polish   Electron Microscopy Sciences 72180  
Electroporation:        
Ketamine   Henry Schein 995-2949  
Xylazine   Henry Schein 4015809TV  
buprenorphine   Henry Schein 1118217  
Picospritzer III   Parker    
BTX square wave electroporator   Fisher BTXECM830  
Tweezertrodes, 7 mm, platinum   Harvard Apparatus 450488  

Riferimenti

  1. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
  2. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
  3. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
  4. Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
  5. Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
  6. Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
  7. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
  8. Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
  9. Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).

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Citazione di questo articolo
Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103, doi:10.3791/2103 (2010).

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