In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip
Summary
Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.
Abstract
Primer nöronal kültürlerin di vitro çalışmada, kantitatif analizler için neurite akıbet sağlar . Genetik değişiklikler nöronal sürecin sonucudur, shRNA veya cDNA yapıları kimyasal transfeksiyon veya viral transdüksiyon yoluyla birincil nöron içine sokulabilir nasıl etkilediğini araştırmak için. Ancak, birincil kortikal hücreler ile, hücre tipleri (farklı katmanları, inhibitör nöronlar, glial hücreler glutamaterjik nöronlar) heterojen bir havuz, bu yöntemleri kullanarak transfekte vardır. Utero elektroporasyon embriyonik kemirgen korteks DNA yapıları tanıtmak için kullanılması hedeflenen hücreleri belirli altkümelerini sağlar: elektroporasyon korteksin erken embriyonik korteks hedefleri derin katmanları, geç embriyonik timepoints az elektroporasyon daha yüzeysel katmanları hedefleri. Ayrıca, dorsal karşı ventral-lateral medial korteks bölgelerinin hedef bireysel embriyolar sonuçları başkanları arasında elektrot diferansiyel yerleştirme. Elektroporasyon ardından, transfekte hücreler, disseke ayrışmış, ve neurite akıbet kantitatif analiz için in vitro kaplı olabilir. Burada, kortikal hücrelerin altkümelerini nöronal sürecin sonucudur kantitatif ölçmek için bir adım-adım yöntemi sağlar.
Utero elektroporasyon protokolün temel Kriegstein laboratuar 1, 2, diğer iki vallahi makalelerde detaylı olarak tarif edilmiştir . Biz en önemli ayrıntıları odaklanarak nöronal sürecin sonucudur gen fonksiyonu çalışmaya utero elektroporasyon geçerlidir protokolün bir açıklama ile takip utero elektroporasyon için protokol genel bir bakış, sağlayacaktır.
Protocol
Discussion
Primer nöronal kültürlerin in vitro çalışmada neurite akıbet kantitatif analizler için izin verir . Genetik değişiklikler nöronal sürecin sonucudur nasıl etkilediğini araştırmak için, shRNA ya da misexpression yapıları kimyasal transfeksiyon veya viral transdüksiyon yoluyla birincil nöron içine sokulabilir. Ancak, birincil kortikal hücreler ile, hücre tipleri (farklı katmanları, inhibitör nöronlar, glial hücreler glutamaterjik nöronlar) heterojen bir havuz, bu yöntemleri kullanara…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, yararlı tartışmalar için bu tekniği Joseph LoTurco ve Dennis Selkoe teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar, bu araştırma desteği için, Amerikan Sağlık Yardım Vakfı bağışçılar teşekkür ederim.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cortical Neuron Preparation | ||||
| Dissection Media: | ||||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | Gibco | 14185-052 | ||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | Gibco | 14065-056 | ||
| 1M HEPES pH 7.4 | Gibco | 15630-080 | ||
| Dishes and Vials: | ||||
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisherbrand | 08-757-12 | ||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351007 | ||
| 15 mL conical vial | Sarstedt | 62-547-205 | ||
| 50 mL conical vial | Sarstedt | 62-554-205 | ||
| Dissection Tools: | ||||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | ||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | ||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | ||
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Miscellaneous: | ||||
| .25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | ||
| Hand-Held Tally Counter | Sigma | Z169021 | ||
| Plating Medium: | ||||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
| Growth Medium: | ||||
| NEUROBASAL Medium | Gibco | 21103-049 | ||
| B-27 Serum-Free Supplement | Gibco | 17504-044 | ||
| GlutaMAX -I Supplement | Gibco | 35050-061 | ||
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15750-060 | ||
| Immunostaining: | ||||
| Fixative, Washes, and Blocking Buffer: | ||||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
| Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | ||
| Antibodies: | ||||
| beta-III tubulin antibody | Chemicon | MAB1637 | ||
| MAP2 antibody | Chemicon | AB15452 | ||
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson Immuno | 715-166-151 | ||
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson Immuno | 703-226-155 | ||
| DAPI | Gibco | D3571 | ||
| Slide Preparation: | ||||
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | ||
| Fluorescent Mounting Media | KPL | 71-00-16 | ||
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | ||
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | ||
| Electroporation: | ||||
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | ||
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | ||
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | ||
| Picospritzer III | Parker | |||
| BTX square wave electroporator | Fisher | BTXECM830 | ||
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
Riferimenti
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
