La fabrication des matériaux injectables d'origine biologique pour l'ingénierie tissulaire du myocarde
Summary
Méthodes de préparation d'une matrice de gel injectable à partir de tissus décellularisé et l'injecter dans le rat myocarde<em> In vivo</em> Sont décrits.
Abstract
Ce protocole fournit des méthodes pour la préparation d'une injection de la matrice extracellulaire (ECM) de gel pour des applications en génie tissulaire du myocarde. En bref, le tissu décellularisé est lyophilisé, broyé, une digestion enzymatique, puis amené à pH physiologique. La lyophilisation supprime tous les contenus de l'eau à partir des tissus, résultant de l'ECM sec qui peut être broyé en poudre fine avec un petit moulin. Après le broyage, la poudre ECM est digéré par la pepsine pour former une matrice injectable. Après ajustement à un pH de 7,4, le matériau de la matrice liquide peut être injecté dans le myocarde. Résultats des tests de caractérisation précédentes ont montré que les gels matrice produite à partir de tissus décellularisé péricardique et myocardique retenir les composants ECM indigènes, y compris des protéines diverses, des peptides et des glycosaminoglycanes. Compte tenu de l'utilisation de ce matériel pour l'ingénierie tissulaire, la caractérisation in vivo est particulièrement utile, ici, un procédé pour effectuer une injection intra-muros dans le ventricule gauche (VG) paroi libre est présenté comme un moyen d'analyser la réponse de l'hôte de la matrice de gel dans les un modèle animal de petite taille. L'accès à la cavité thoracique est acquise à travers le diaphragme et l'injection est faite légèrement au-dessus de l'apex dans le mur BT libre. L'origine biologique échafaudage peuvent être visualisées par la biotine-étiquetage avant l'injection puis coloration des coupes de tissus avec un raifort conjuguée à la peroxydase et la visualisation via neutravidine diaminobenzidine (DAB) coloration. Analyse de la région d'injection peut aussi être fait avec coloration histologique et immunohistochimique. De cette façon, les gels déjà examiné la matrice péricardique et du myocarde ont été montrés à la forme fibreuse, réseaux poreux et de promouvoir la formation des vaisseaux dans la région d'injection.
Protocol
Discussion
Cette méthode permet la génération d'origine biologique, les échafaudages injectable pour l'ingénierie tissulaire du myocarde. Bien que ces méthodes ont été initialement développées pour la fabrication et des essais in vivo d'un gel de la matrice du myocarde et présenté ici avec une matrice de gel péricardique, ce protocole peut être adapté pour une utilisation avec n'importe quel tissu, pourvu que le tissu peut être appropriée décellularisé. Décellularisation doit ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée en partie par le directeur des NIH Programme Innovateur nouveau prix, le cadre de la Feuille de route du NIH pour la recherche médicale, à travers le numéro de subvention 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. tiens à remercier la NSF pour une bourse de recherche de deuxième cycle.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents: | ||||
| Pepsin | Sigma-Aldrich | p6887-1G | Lyophilized | |
| Biotin | Thermo Scientific | 21217 | ||
| Neutravidin-HRP | Thomas Scientific | 21130 | ||
| Equipment: | ||||
| Wiley Mini Mill | Thomas Scientific | 3383L10 | ||
| Labconco Lyophilizer | Labconco, Inc | 7670520 | ||
| Surgical supplies: | ||||
| Betadine | Purdue Products, L.P. | 67618-154-16 | ||
| Lactated Ringers Solution | MWI | 003966 | ||
| KY Jelly | MWI | 28658 | ||
| Lidocaine, 2% | MWI | 17767 | ||
| Buprenorphine hydrochloride | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd. | 12496-0757-1 | ||
| Artificial tear ointment | Fisher | NC9860843 | ||
| Triple antibiotic ointment | Fisher | 19082795 | ||
| Isoflurane | MWI | 60307-120-25 | ||
| Otoscope | MWI | 008699 | ||
| Stop cock | MWI | 006245 | ||
| 3-0 Vicrile suture | MWI | J327H | ||
| 5-0 Proline suture | MWI | s-1173 | ||
| Reverse cutting (RC) needle | Ethicon | 8684G | ||
| Microhemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | ||
| Rat tooth microforceps | Fine Science Tools | 11084-07 | ||
| No. 10 scalpel | Fine Science Tools | 10110-01 | ||
| Blunt scissors | Fine Science Tools | 14108-09 | ||
| Sharp, curved scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
| Large, serrated forceps | Fine Science Tools | 1106-12 | ||
| PE160 suction tubing | BD | 427430 | ||
| Clippers | MWI | 21608 | ||
| Skin staples/stapler | Ethicon | PRR35 | ||
| General supplies: | ||||
| Stir plates | ||||
| 0.1 M HCl | ||||
| 1 M NaOH | ||||
| 10x PBS | ||||
| 1x PBS | ||||
| 70% Ethanol | ||||
| 0.1 mL syringes | ||||
| 10 mL syringe | ||||
| Q-tips | ||||
| Surgical glue | ||||
| Surgical drape | ||||
| Towel clamps | ||||
| Small hand-held vacuum |
Riferimenti
- Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering. , (2009).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29, 1630-1630 (2008).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3675 (2006).
- Liao, J., Joyce, E. M., Sacks, M. S. Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet. Biomaterials. 29, 1065-1065 (2008).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30, 5409-5409 (2009).
- Christman, K. L., Vardanian, A. J., Fang, Q., Sievers, R. E., Fok, H. H., Lee, R. J. Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium. J Am Coll Cardiol. 44, 654-654 (2004).
- Christman, K. L., Fok, H. H., Sievers, R. E., Fang, Q., Lee, R. J. Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. 10, 403-410 (2004).
- Huang, N. F., Sievers, R. E., Park, J. S., Fang, Q., Li, S., Lee, R. J. A rodent model of myocardial infarction for testing the efficacy of cells and polymers for myocardial reconstruction. Nat Protoc. (1), 1596-1609 (2006).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., Goh, S. K., Black, L. D., Kren, S. M., Netoff, T. I. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
