Fabbricazione di derivazione biologica Materiali iniettabili per l'ingegneria tissutale miocardica

Summary

Metodi per la preparazione di un gel iniettabile matrice dal tessuto decellularized e iniettarlo nel ratto miocardio In vivo Sono descritti.

Abstract

Questo protocollo fornisce i metodi per la preparazione di un iniettabile matrice extracellulare (ECM) gel per applicazioni di ingegneria dei tessuti del miocardio. In breve, il tessuto decellularized è liofilizzato, macinato, digerito enzimaticamente, e poi portato a pH fisiologico. La liofilizzazione elimina tutto il contenuto di acqua dal tessuto, con conseguente ECM secco che può essere macinato in una polvere fine con un piccolo mulino. Dopo la fresatura, la polvere ECM viene digerito con pepsina per formare una matrice iniettabile. Dopo aggiustamento a pH 7,4, il materiale della matrice liquido può essere iniettato nel miocardio. Risultati dei dosaggi caratterizzazione precedenti hanno dimostrato che i gel matrice prodotta dal tessuto miocardico decellularized pericardico e conservare i componenti nativi ECM, tra cui diverse proteine, peptidi e glicosaminoglicani. Dato l'utilizzo di questo materiale per l'ingegneria tissutale, caratterizzazione in vivo è particolarmente utile, qui, un metodo per eseguire una iniezione intramurale nel ventricolo sinistro (LV) parete libera è presentato come un mezzo per analizzare la risposta dell'ospite al gel matrice un modello animale di piccole dimensioni. L'accesso alla cavità toracica si ottiene attraverso il diaframma e l'iniezione è fatta leggermente sopra l'apice nel muro LV libero. La derivazione biologica impalcatura può essere visualizzata da biotina-etichettatura prima dell'iniezione e poi colorazione sezioni di tessuto con un rafano perossidasi-coniugato neutravidin e la visualizzazione tramite diaminobenzidina (DAB) colorazione. Analisi della regione di iniezione può essere fatto anche con colorazione istologica ed immunoistochimica. In questo modo, i gel già esaminato matrice pericardio e del miocardio hanno dimostrato di forma fibrosa, reti poroso e promuovere la formazione di vasi all'interno della regione di iniezione.

Protocol

1. Pre-elaborazione del tessuto di preparazione

1. Prima di utilizzare questo protocollo, si deve avere già decellularized il tessuto di scelta. Per questo esempio, suina fresca e campioni pericardio umano sono decellularized con risciacqui ipotoniche e ipertoniche in deionizzata (DI) e dodecil solfato di sodio (SDS).
2. In particolare, prima lavare il pericardio porcino in acqua deionizzata per 30 minuti, quindi mescolare continuamente in 1% SDS a tampone fosfato (PBS) per 24 ore, seguito da un ore di acqua 5 di risciacquo. Per pericardia umana, primo risciacquo in acqua deionizzata per 30 minuti, quindi mescolare continuamente in SDS 1....

Discussion

Questo metodo consente la generazione di derivazione biologica, scaffold iniettabili per l'ingegneria tissutale del miocardio. Anche se questi metodi sono stati inizialmente sviluppati per la fabbricazione e la sperimentazione in vivo di un gel matrice del miocardio e presentato qui con un gel matrice pericardico, questo protocollo può essere adattato per essere utilizzato con qualsiasi tessuto, a condizione che il tessuto può essere opportunamente decellularized. Decellularization deve essere eseg.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenti:
Pepsina	Sigma-Aldrich	p6887-1G	liofilizzata
	Thermo Fisher Scientific, Inc.	21217
Neutravidin-HRP	Thomas Scientific	21130
Attrezzatura:
Wiley Mini Mill	Thomas Scientific	3383L10
Labconco Liofilizzatore	Labconco Corp.	7670520
Forniture chirurgiche:
Betadine	Purdue Products L.P.	67618-154-16
Soluzione di ringer lattati	MWI Fornitura veterinaria	003966
KY Jelly	MWI Fornitura veterinaria	28658
Lidocaina, 2%	MWI Fornitura veterinaria	17767
Buprenorfina cloridrato	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Unguento lacrimale artificiale	Fisher Scientific
Unguento antibiotico triplo	Fisher Scientific	19082795
Isoflurano	MWI Veterinary Supply	60307-120-25
Otoscopio	MWI Veterinary Supply	008699
Rubinetto di arresto	MWI Veterinary Supply	006245
3-0 Sutura vicrile	MWI Veterinary Supply	J327H
5-0 Sutura Proline	MWI Veterinary Supply	s-1173
Ago a taglio inverso (RC)	Ethicon Inc.	8684G
Microemostatici Strumenti per le	scienze	13013-14
Micropinze per denti di ratto	Strumenti per le scienze	11084-07
Bisturi n. 10	Strumenti per le scienze	10110-01
Forbici smussate	Strumenti per le scienze	14108-09
Forbici affilate e curve	Strumenti per le scienze	14085-08
Pinza grande e seghettata	Fine Science Tools	1106-12
PE160 tubo di aspirazione	BD Biosciences	427430
Clippers	MWI Veterinary Supply	21608
Graffe per pelle/cucitrice	Ethicon Inc.	PRR35
Forniture generali:
Piastre
0,1 M HCl
1 M NaOH
10x PBS
1x PBS
70% Etanolo
0,1 mL siringhe siringa
da 10 mL Cotton
fioc
Colla
Telo
Morsetti per asciugamani
vuoto