De Methode van Knaagdieren Hele Embryo Cultuur met behulp van de Rotator-type Bottle Cultuur System
Summary
Hele embryo cultuur techniek stelt ons in staat om de cultuur muis en rat embryo's<em> Ex vivo</em> Conditie tijdens een beperkte periode die overeenkomt met midgestation fasen. In deze video protocol, tonen wij onze standaard procedures van de rat gehele embryo cultuur na E12.5 het gebruik van de rotator-type fles cultuur-systeem.
Abstract
Hele embryo cultuur (WEC) techniek is ontwikkeld in 1950 is door de New en zijn collega's, en toegepast voor ontwikkelingsbiologie 1. Hoewel de ontwikkeling en groei van zoogdieren embryo's zijn sterk afhankelijk van de functie van de placenta, WEC-techniek stelt ons in staat om de cultuur muizen en ratten embryo's ex vivo conditie tijdens een beperkte periode die overeenkomt met midgestation etappes tijdens de embryonale dag (E) 6.5-E12.5 in de muis of E8.5-E14.5 in de rat 2, 3, 4. In de WEC, kunnen we direct richten gewenste gebieden van embryo's met behulp van fijne glazen capillairen, omdat embryo's kunnen worden gemanipuleerd onder de microscoop. Daarom, knaagdier WEC is erg nuttige techniek als we willen dynamische ontwikkelingsprocessen van postimplanted zoogdieren embryo's te bestuderen. Tot op heden hebben verschillende types van WEC systemen ontwikkeld: 1. Onder hen, de rotator-type fles cultuur-systeem is het meest populair en geschikt voor de lange termijn de cultuur van embryo's op midgestation, dat wil zeggen, na E9.5 en E11.5 in de muis en rat, respectievelijk 1. In deze video protocol, tonen wij onze standaard procedures van de rat WEC na E12.5 met behulp van een verfijnd model van de oorspronkelijke rotator systeem, dat werd ontworpen door nieuwe en Cockroft 5, 6, en de invoering van de verschillende toepassingen van WEC techniek voor studies in zoogdieren ontwikkeling biologie.
Protocol
Discussion
Er zijn twee belangrijke stappen in het knaagdier WEC voor het succes. Ten eerste moet de dissectie procedure nauwkeurig niet te beschadigen embryo's, in het bijzonder de bloedvaten. Ten tweede moet de procedure worden zo snel mogelijk, omdat zuurstof en voedingsstoffen worden niet meer gevoed via de placenta na isolatie uit de baarmoeder. Dit is essentieel voor oudere embryo's. In het geval van rat WEC na E12.5, moeten we overdragen ontleed embryo's in de cultuur flessen binnen 30 minuten.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de heer Hajime Ichijo voor video-opname en nuttige adviezen voor het bewerken van de video. We danken ook Drs.Yuji Tsunekawa en Kaichi Yoshizaki voor soort assistent voor video-opname. Dit werk wordt ondersteund door KAKENHI op Young Scientist B en op prioritaire gebieden-Molecular Brain Science van MEXT van Japan. Wij erkennen de steun van Global COE-programma 'Basic and Translational Research Center for Global Brain Science "van MEXT van Japan en de Core Research voor Evolutionaire Wetenschap en Technologie (CREST) van de Japanse Science and Technology Corporation uit Japan Science and Technology Agency (JST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comment |
| Setting up WEC | ||||
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | – | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | Millipore | SLGS033SS | |
| Anesthesia and isolation of the uterus | ||||
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) |
Tool | Iwaki | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Schering-Plough Animal Health | – | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | – | – | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. |
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles Rivers Laboratories Japan | – | |
| Preparation of culture medium | ||||
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any company | – | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | Becton Dickinson | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles Rivers Laboratories Japan | – | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | Gibco | 15240 | |
| Dissection of embryos | ||||
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | – | – | Made by hand using Pasteur pipette. |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
- New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 1-14 (1990).
- Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 15-40 (1990).
- Morris-Kay, G. M. Postimplantation mammalian embryos. Essential Developmental Biology A Practical Approach. , 55-66 (1993).
- Fujinaga, M., Tuan, R. S., Lo, C. W. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. Developmental Biology Protocols. , 53-76 (2000).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. Mammalian craniofacial embryology in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).
- Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate. Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization. Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Arai, Y. Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex. J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
