שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק
Summary
טכניקה שלמים תרבות העובר מאפשר לנו עכבר התרבות עוברי חולדה<em> לשעבר vivo</em> מצב בתקופות מוגבל המתאים בשלבים midgestation. בפרוטוקול הווידאו הזאת, אנחנו מדגימים את הנהלים תקן של התרבות שלנו עובר שלם חולדה לאחר E12.5 באמצעות המפרק מסוג התרבות מערכת בקבוק.
Abstract
העובר שלמים תרבות (WEC) הטכניקה פותחה בשנת 1950 על ידי בניו של וחבריו, והגיש בקשה בביולוגיה התפתחותית 1. למרות התפתחות וצמיחה של עוברי יונקים תלויים באופן קריטי על תפקוד השליה, WEC הטכניקה מאפשרת לנו עכבר התרבות עוברי חולדה מצב vivo לשעבר בתקופות מוגבל המתאים בשלבים עובריים midgestation במהלך היום (ה ') 6.5-E12.5 ב עכבר או E8.5-E14.5 בחולדה 2, 3, 4. ב WEC, אנחנו יכולים ישירות ליעד המבוקש תחומי עוברים באמצעות קנס זכוכית הנימים כי עוברי ניתן להשפיע מתחת למיקרוסקופ. לכן, WEC מכרסם הוא טכניקה שימושית מאוד כאשר אנו רוצים ללמוד תהליכים התפתחותיים הדינמי של עוברי יונקים postimplanted. עד כה, מספר סוגים של מערכות WEC פותחו 1. בין אלה, את הכתף מסוג התרבות מערכת בקבוק הוא הפופולרי ביותר מתאים לתרבות לטווח ארוך של עוברים ב midgestation, כלומר, לאחר E9.5 ואת E11.5 של העכבר חולדה, בהתאמה 1. בפרוטוקול הווידאו הזאת, אנחנו מדגימים את הנהלים הרגילה שלנו של WEC עכברוש לאחר E12.5 באמצעות מודל מזוקק של מערכת המפרק המקורי, אשר תוכנן על ידי ניו Cockroft 5, 6, ו להציג יישומים שונים של טכניקת WEC ללימודי התפתחותי יונקים הביולוגיה.
Protocol
Discussion
ישנם שני שלבים קריטיים WEC מכרסם להצלחה. ראשית, הליך לנתיחה צריך להיות מדויק ולא עוברים נזק, בעיקר כלי הדם. שנית, ההליך צריך להיות מהר ככל האפשר כי החמצן מזין אינם מסופקים דרך השליה לאחר במנותק מן הרחם. זה קריטי עוברים יותר. במקרה של WEC עכברוש לאחר E12.5, אנחנו צריכים להעביר …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למר האג'ימה Ichijo עצות עבור וידאו הקלטה מועיל עבור עריכת וידאו. כמו כן, אנו מודים Drs.Yuji Tsunekawa ו Kaichi Yoshizaki עבור עוזר סוג הקלטה וידאו. עבודה זו נתמכת על ידי KAKENHI על B המדען הצעיר על תחומי המדע, מולקולרית המוח עדיפות מ MEXT של יפן. אנו מכירים את התמיכה של גלובל COE תוכנית "יסוד Translational המרכז לחקר מדעי המוח גלובל" מ MEXT של יפן המחקר Core למדע וטכנולוגיה Evolutional ו (CREST) מתוך מדעי החברה היפנית למדע וטכנולוגיה של היפנים הסוכנות וטכנולוגיה (JST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comment |
| Setting up WEC | ||||
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | – | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | Millipore | SLGS033SS | |
| Anesthesia and isolation of the uterus | ||||
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) |
Tool | Iwaki | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Schering-Plough Animal Health | – | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | – | – | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. |
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles Rivers Laboratories Japan | – | |
| Preparation of culture medium | ||||
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any company | – | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | Becton Dickinson | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles Rivers Laboratories Japan | – | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | Gibco | 15240 | |
| Dissection of embryos | ||||
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | – | – | Made by hand using Pasteur pipette. |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
- New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 1-14 (1990).
- Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 15-40 (1990).
- Morris-Kay, G. M. Postimplantation mammalian embryos. Essential Developmental Biology A Practical Approach. , 55-66 (1993).
- Fujinaga, M., Tuan, R. S., Lo, C. W. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. Developmental Biology Protocols. , 53-76 (2000).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. Mammalian craniofacial embryology in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).
- Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate. Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization. Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Arai, Y. Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex. J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
