CFSE التسميات تساهميا المعمرة الجزيئات داخل الخلايا مع صبغة الفلورسنت ، carboxyfluorescein. على هذا النحو ، وعندما خلية CFSE المسمى القسمة ، وعلى آله ونصف كمية مضان ، والتي يمكن بالتالي استخدامها لتقييم انقسام الخلايا. توضح هذه المقالة الإجراءات التي تستخدم عادة لوضع العلامات اللمفاويات الفأر مع CFSE.
Carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) هو وسيلة فعالة لرصد والشعبية لمفاوية 1-3 الانقسام. CFSE التسميات تساهميا المعمرة الجزيئات داخل الخلايا مع صبغة الفلورسنت ، carboxyfluorescein. وهكذا ، عندما خلية CFSE المسمى القسمة ، وهبوا ذرية مع نصف عدد carboxyfluorescein الموسومة الجزيئات ، وبالتالي يمكن تقييم كل انقسام الخلايا عن طريق قياس انخفاض مماثل في مضان الخليوي عبر التدفق الخلوي. قدرة CFSE لتسمية السكان اللمفاويات مع كثافة عالية من التباين الفلورية منخفضة بشكل استثنائي ، إلى جانب خلية سميتها منخفضة ، تجعل من صبغة مثالية لقياس انقسام الخلايا. نظرا لأنه هو صبغ فلوريسئين المستندة كما أنه متوافق مع مجموعة واسعة من fluorochromes الأخرى مما يجعلها تنطبق على التدفق الخلوي متعددة الألوان. توضح هذه المقالة الإجراءات التي تستخدم عادة لوضع العلامات اللمفاويات الماوس لغرض رصد ما يصل إلى 8 الانقسامات الخلوية. ويمكن استخدام هذه الخلايا المسمى على حد سواء لفي التجارب المختبرية والدراسات المجراة.
لكي نقدر كيف ولماذا تعمل CFSE مطلوب السريع وسم موحدة لاستخدامها في تحليل انتشار الأسلحة النووية ، فإنه من المفيد لفهم الأساس الجزيئي للخلايا CFSE الوسم. ويمكن تقسيم هذه إلى مرحلتين ، 1) دخول الخلية و2) وضع العلامات البروتين (الشكل 3). 1) دخول الخلية : هو بوساطة دخول الصبغة إلى الخلية بواسطة النموذج diacetylated للصباغة ، carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات succinimidyl استر (CFDA ، SE). والأسيتات جعل الصبغة نفيذ غشاء يسمح للغاية التمويه السريع عبر غشاء البلازما. Esterases والحاضر داخل الخلية ، ويلتصق من الأسيتات CFDA ، SE ، وبالتالي تؤدي إلى النموذج CFSE للصباغة الذي هو أقل بكثير نفيذ الغشاء ، وبالتالي التركيز على الصبغة داخل الخلية. 2) وضع العلامات البروتين : في حين أن كلا CFDA ، SE وCFSE الأمينية والتفاعل سلاسل الجانب succinimidyl ، فقط هو CFSE الفلورسنت. تركيز عال من الخلايا CFSE يسهل السريع وارتفاع مستوى الخلايا وسم من البروتينات. ويجب أن يؤدي وضع العلامات CFSE من الخلايا بسرعة من أجل الحصول على السكان المسمى متجانس من الخلايا ، وهو أمر حاسم لتسوية الخلايا التي تعرضت لانقسامات عدة كما هو موضح في نتائج ممثل (الشكل 1 و 2).
The authors have nothing to disclose.
وأيد العمل التي أعلن عنها في هذه المادة من قبل الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) في أستراليا برنامج المنحة (CRP) ومشروع NHMRC غرانت (CRP وBJCQ). كما BJCQ زميل بيتر دوهرتي NHMRC ما بعد الدكتوراه.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CFDA,SE | Molecular Probes | |||
DMSO | Cambridge Isotope Laboratories Inc. | |||
Lymphocytes | eg mouse or human | |||
RPMI | Gibco | |||
FCS | SAFC Biosciences | |||
10-15ml conical tubes | Falcon, Becton Dickinson | |||
PBS | Gibco | |||
Aluminium foil | Capral Aluminium | |||
Vortex | Scientific Industries | |||
Centrifuge | Eppendorf (5810 R) | |||
Flow cytometer | LSR-II (BD Biosciences) |