Genetische associaties blijven vaak onverklaarbare op een functioneel niveau. Deze methode heeft tot doel het effect van de fenotype-geassocieerde genetische markers te beoordelen op gen-expressie door het analyseren van cellen heterozygoot voor getranscribeerd SNPs. De technologie maakt het mogelijk nauwkeurig te meten door middel van MALDI-TOF massaspectrometrie om allel-specifieke primer extension producten te kwantificeren.
Het aantal significante genetische associaties met gemeenschappelijke complexe eigenschappen wordt steeds groter. Toch hebben de meeste van deze verenigingen niet begrepen op moleculair niveau. Een van de mechanismen bemiddelende het effect van de DNA-varianten op de fenotypes is genexpressie, die is aangetoond dat het bijzonder relevant voor complexe eigenschappen 1.
Deze methode tests in een cellulaire context het effect van specifieke DNA-sequenties op gen expressie. Het principe is het meten van de relatieve overvloed van transcripten die voortvloeien uit de twee allelen van een gen, het analyseren van cellen die een kopie van de DNA-sequenties geassocieerd met de ziekte (het risico varianten) 2,3 dragen. Daarom moet de cellen die voor deze methode voldoet aan twee fundamentele genotypische eisen: ze moeten heterozygoot zijn voor zowel DNA-varianten het risico en voor het DNA-merkers, meestal codering polymorfismen, die kan onderscheiden transcripties op basis van hun chromosomale herkomst (figuur 1). DNA-risico varianten en DNA-merkers hoeven niet hetzelfde allel frequentie hebben, maar de fase (haplotypic) relatie van de genetische markers moet worden begrepen. Het is ook belangrijk om te kiezen celtypen die het gen van belang uit te drukken. Dit protocol verwijst specifiek naar de procedure goedgekeurd om nucleïnezuren uittreksel uit fibroblasten, maar de methode is ook toepasbaar op andere cellen te types inclusief primaire cellen.
DNA en RNA worden geëxtraheerd uit de geselecteerde cellijnen en cDNA wordt gegenereerd. DNA en cDNA worden geanalyseerd met een primer extensie test, ontworpen om de coderende DNA-merkers 4 target. De primer extensie test is uitgevoerd met behulp van MassARRAY (Sequenom) 5-platform volgens de specificaties van de fabrikant. Primer extensie producten worden vervolgens geanalyseerd door matrix-assisted laser desorptie / ionisatie tijd of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF/MS). Omdat de geselecteerde markers heterozygoot zijn ze genereren twee pieken op de MS profielen. De oppervlakte van elke piek is evenredig met de transcript overvloed en kan gemeten worden met een functie van de MassARRAY Typer software om een allele-ratio (een allel: allel 2) het genereren van berekening. De allelische verhouding verkregen cDNA is genormaliseerd met behulp van dat gemeten vanaf genomisch DNA, waar de allel-ratio naar verwachting 1:01 om te corrigeren voor technische artefacten. Markers met een genormaliseerde allelische verhouding aanzienlijk anders dan een aan te geven dat de hoeveelheid transcript gegenereerd uit de twee chromosomen in dezelfde cel verschillend is, wat suggereert dat het DNA-varianten worden geassocieerd met het fenotype een effect op genexpressie hebben. Experimentele controles moeten worden gebruikt om de resultaten te bevestigen.
Deze methode maakt de evaluatie van het effect van de ziekte-geassocieerde DNA-varianten op genexpressie door het beoordelen van in vivo allel-specifieke verschillen in transcript niveau. In dit protocol relatieve overvloed transcript wordt gemeten door middel van MALDI-TOF, maar andere technologieën waardoor allel-specifieke kwantificering, zoals de TaqMan 6,7, kunnen worden gebruikt. De belangrijkste beperking van deze aanpak is de beschikbaarheid van getranscribeerd codering markers. Methoden op basis van het principe hier beschreven, maar gebruik te maken van verschillende klassen van polymorfismen, zijn beschreven. De haploChip test meet allel-specifieke expressie met behulp van markers zich binnen een kb van de transcriptie begin of het einde plaats van een gen dat aanwezig zou zijn in chromatine immunogeprecipiteerd materiaal geïsoleerd met antilichamen die specifiek RNA polymerase II 8. Als alternatief kan intronische SNPs worden gebruikt wanneer de sjabloon wordt heteronucleair RNA 9.
De specifieke protocol hier beschreven, in combinatie met de haploChip assay, is met succes gebruikt om een kandidaat-gen voor dyslexie (of lezen handicap) te identificeren. In eerste instantie een genetische associatie studie is een DNA-sequentie in verband met dyslexie en die is verspreid over drie genen 10. Het allel-specifieke genexpressie test toonde aan dat in de aanwezigheid van de dyslexie-geassocieerde DNA-varianten uitdrukking variatie werd waargenomen bij slechts een van de drie genen, maar niet de andere twee 11.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
PBS | Sigma | P-4417-100TAB | ||
SDS | Biorad | 161-0416 | ||
NaCl | VWR | 27788.366 | ||
Tris | Sigma | T1503-1KG | ||
EDTA | Sigma | E5134-500G | ||
RNase A | Qiagen | 19101 | ||
Proteinase K | Sigma | P2308-500MG | ||
Phenol: chloroform | Sigma | 77617 | ||
Chloroform | VWR | 100777C | ||
Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | ||
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | ||
RNeasy kit | Qiagen | 74104 | ||
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | ||
Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | ||
dNTP | Sigma | DNTP100A | ||
Exonuclease 1 | NEB | M0293S | ||
Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | ||
SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | ||
MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | ||
MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | ||
Equipment | ||||
Chilled microcentrifuge | Eppendorf | |||
NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | |||
SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | |||
SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |