Summary
C57BL / 6マウスがHcの病因を研究し、最適なモデルを提供するために使用されています。我々は、この菌に対する体液性免疫の潜在的な利点を模索し、[ヒストンH2Bと熱ショック蛋白質の60kDaへ]いくつかのモノクローナル抗体を生成している我々は腹腔内投与後、その予防効果を試験すること。
Abstract
この方法論の利用目的は、抗体または真菌ヒストプラスマカプスラーツム 、2）治療の標的として、病原性因子の役割を検討することによって引き起こされるヒストプラズマ症を予防または治療用ワクチンを持つ個人を保護するために私たちの能力を前進させる）1です。モノクローナル抗体を生成するには、マウスを免疫し、免疫応答は、私たちの研究室で開発された固相ELISAシステムを用いて評価され、最高の応答者のマウスハイブリドーマ細胞との融合の脾細胞の単離のために選択されています。 C57BL / 6マウスは広範囲にH.を研究するために使用されているcapsulatum病因と必要なデータを取得するための最良のモデルを提供しています。感染症におけるモノクローナル抗体の役割を評価するためには、マウス腹腔内には、H.するモノクローナル抗体のいずれかで投与されていますcapsulatumまたはアイソタイプは、静脈内（IV）、腹腔内（ip）、または鼻腔内（の）路線で対照mAbを一致して感染する。科学文献では、マウスの真菌感染症に対するモノクローナル抗体の有効性は、以前の時点でコロニーのforminユニット（CFU）の評価と組み合わせて、エンドポイントとして死亡率に依存しています。彼らは最高の人間の病気を表すように生存（死亡までの時間）の研究が必要である。したがって、我々の介入の有効性は十分に生存曲線なしで確立されませんでした。これは、ワクチンや病原性変異体のテストの有効性を確立する場合も同様です。ヒストプラスマ症で、マウスは、しばしば数時間以上の死者への精力的であることから行く。そのような抗体の投与等の介入の容量は最初に病気から動物を保護することがありますが、病気が短いCFUの実験で再発を実現できないということができる。生存と真菌負担アッセイに加えて、我々は感染症（組織、細胞の採用、サイトカイン応答）に炎症反応を調べる。生存/死の実験に時間のために、マウスは罹患率の兆候を少なくとも1日2回感染して監視されます。真菌の負担、組織病理学、およびサイトカイン応答を評価するために、マウスは感染後の様々な時点で安楽死されています。動物実験は医学のアルバートアインシュタイン大学の動物学研究所のガイドラインにしたがって実行されます。
Protocol
1。 H.の成長Capsulatum
- 20分の紫外線照射で10％の漂白剤でキャビネットをクリーニングして菌を使用のためのバイオセーフティキャビネットを準備します。H.金型のフォームがBSLIIIを必要としながら酵母の段階でcapsulatumは 、 バイオセーフティレベル（BSL）IIの実践が必要です。次の手順で、酵母のフォームを使用してください。
- 次にPBS 5 mlで15 mlコニカルチューブを準備する。 H.のコロニーを収穫BHI血液寒天プレートからcapsulatum（株Hcは ATCC G217B）[グルコース10g / Lの、システイン0.1g / Lの、ペニシリン-ストレプトマイシン1％、ヒツジ赤血球を50ml / L（コロラド血清（株）、コロラド州、米国） ] 37℃で培養または-80℃で凍結した酵母株からアリコートを取り、PBSに追加します。激しくボルテックス細胞を、室温で10分間1100 × gで間遠心します。慎重にペレットが剥がれないように上清を除去し、新鮮なPBS 10mlのを追加します。この手順を3回繰り返します。 50 mLコニカルチューブにPBSとトランスファーの5mLの中に細胞を懸濁する。
- 凝集細胞を破壊するために、26 G1 / 2針を介して酵母の細胞懸濁液を渡すuはバイオセーフティキャビネット（顔の保護を使って）に10mLのシリンジを5回歌う。小さい、均一サイズの酵母を分離するには、室温で1分間を55 × gで細胞を遠心分離し、上位1 mlを削除します。
- 、16グラム/ Lグルコースを添加したHAM F12培地（GIBCO）を100 mlを含む滅菌三角フラスコに細胞懸濁液を追加して1グラム/ Lグルタミン酸、8.4mg / Lシスチン、6グラム/ Lグルタミン酸、その後37℃で細胞を育てる揺れ150rpmでインキュベーターで48時間° C。
2。モノクローナル抗体のハイブリドーマの増殖と精製
- 10％ウシ胎児血清、10％のNCTC、1％非必須アミノ酸、1％ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEM培地に選択したハイブリドーマを転送する。 37℃で5-7日間細胞培養フラスコ（ベクトンディッキンソン）で細胞を成長させる℃/ 5％CO 2。
- その後、室温で10分間、1100 × gで培地を遠心し、ペレットを中断することなく、すべての上清を集める。
- 次に、FPLCによってプロテインA / G樹脂を用いて無細胞上清を精製する。
- モノクローナル抗体の濃度は、標準としてのIgGアイソタイプコントロール（図1B）を使用してキャプチャELISA（1）によって計算することができます。
（3） ヒストプラスマカプスラーツムの 接種の準備
- HAM F - 12培地で増殖させた48時間ヒストプラスマカプスラーツム （株Hcは ATCC G217B）酵母の相の文化を取る。
- 10分1100 xgで細胞を遠心分離します。上清を捨て、新しいPBSを加える。
- 3.2の手順を3回繰り返します。
- 注射器を使用して26G1 / 2針を通して酵母の細胞懸濁液を5回渡す。
- ペレット残留細胞のクラスターへ1分、55 × gで懸濁液を遠心分離します。新しいチューブに単一の細胞懸濁液を含む上清を移す。
- 血球計数器を用いて、単一の細胞懸濁液を列挙する。
- <50μL（図2）のサスペンションで1.25 × 10 7酵母（生存）または5.0 × 10 6（CFU、サイトカイン及び組織学を）達成するために、細胞濃度を調整します。
4。モノクローナル抗体の腹腔内投与
- 尾と首の首筋（図3A）でマウスを拾う。できるだけtheears（;図3Bと3Cマウスはそれを扱う人を噛まないようにその頭をcannotturnように、十分な皮膚を取ることを確認してください）に近いとして、その首の首筋でマウスを固定化する。
- そっと手のひら（図3D）押し付けテールwiththe小指を安定させる。
- 注入前に血液を探すために吸引する綿棒針を置く前に70％エタノールで注入領域と。
- で、thelowerの左または右下腹部（腹腔内腔）に500μgを（PBS、アイソタイプコントロール抗体またはモノクローナル抗体1mLのPBSで希釈し、テストする）を含む抗体溶液を注入するために皮膚とabdominalmusclesをpiercetheする26G1 / 2を使用ダイヤフラムandother内臓（図3E）をしないように注意しながら下の位置に頭の中で動物、。
- needletoが漏れの可能性を減らす撤退する前にしばらく待って。
- 次のステップに進む前に二時間以上待つ。
5。マウスの麻酔と鼻腔内感染症
- は100 mg / kg及び10 mg / kgを、それぞれでケタミンとキシラジンを使用して麻酔を準備します。腹腔内のPBSを投与、アイソタイプコントロール抗体、またはそれに関するプロトコルで説明されているように実験的な抗体を実行します。マウスを麻酔し、鼻腔感染症に進む前に、モノクローナル抗体の注射後2時間待機する。
それぞれ100 mg / kgおよび10 mg / kgを、（7）で、ケタミンとキシラジンを使用して麻酔を準備します。 - 2H待機期間中は、添付の書かれたプロトコルで説明されているヒストプラスマcapsulumの接種を準備する。
- itens 5.1から5.5にしたがって進んでください。ピンセットで動物を挟まないようTOEと反射がないことを確認し、麻酔が働いていることを確認する。anaesthetization後、軽くナイロンや綿の文字列にその前歯でマウスを中断。動物を中断するために文字列を結びつけるために2列のスタンドを使用してください。
- 密接にマウスの呼吸数をモニターしながら徐々にマイクロピペットを用いてナーレに約50μl接種を管理する。マウスは、動物の肺（図3F）に酵母の沈着を促進するために、鼻腔内感染後2〜5分間のためにこの姿勢で休息することができます。
- マウスが感染された後、必要に応じて、麻酔から回復するまで慎重に、ヒートランプを利用し、監視し、暖かい環境（25〜37℃間の温度）でマウスを維持する。ときにマウスの目を覚まし、食物と水に随意アクセス権を持つクリーンなケージに戻します。 ケージは私たちの動物施設に戻されるときれいな動物室（BLSI）に保管されている。
6。生存学
- 頻呼吸、嗜眠、鈍麻、および体重減少のために臨床的に感染したとモック感染動物を評価する。動物は、実験室のメンバーと動物の世話で毎日が毎日二度チェックする必要があります。
- マウスヒストプラスマ症で、人生の終わり近くになるまで、呼吸数の軽度の増加以外の感染の明らかな兆候は、通常ありません。 通常10〜11日から起こる先進的な疾患で、マウスは著しくtachypneicになり、活動減退している。通常、彼らは急速に瀕死状態になると期限切れになります。
- 苦しめられた動物は、専用のチャンバー内のCO 2を適切に安楽死されるべきである、死亡動物は毎日列挙すべきである。
7。 CFU学、組織学およびサイトカインの研究
- 収集する各臓器に対して10mLのPBSで15 mlコニカルチューブを準備します。
- 前述のように亜致死inuculum（5.0 × 10 6）を持つ動物7と感染後14日を安楽死させるとすぐに肺、脾臓と肝臓を取り除く。
- 評価される臓器の一部を削除し、ホルマリンで一晩固定を行います。セクションは、病理学的評価のための顕微鏡で検査されます。
- 5mLのPBSで50 mlコニカルチューブを準備するには、均質化するために各臓器に対して70μmのセルストレーナーをトッピング。滅菌5mLのシリンジのプランジャを使用して50 mLチューブに別々の臓器の残りの各部分を痩せ衰えさせる。
- 次に、シリアルBHI血液寒天プレート（2）で臓器のホモジネート（1:100、1:1000と1:5000）と各希釈のプレートで100μLに希釈します。
- 製造者の指示（Roche社、ドイツ）にしたがってホモジネートするプロテアーゼ阻害剤の錠剤を追加。
- ° C 14日間および列挙外装フィルムの上まで、37でプレートをインキュベートする。
- 10分間4000xgで臓器のホモジネートを遠心し、臓器の上清を除去、シューッという音は、メーカーによると、標準的な方法によって実行されるサイトカインのアッセイで使用で使用されます。
8。 H.に対するモノクローナル抗体の保護Capsulatumは、抗体の特異性およびアイソタイプに依存しています
- モノクローナル抗体アイソタイプは、H.に対する保護において重要であるcapsulatumは 、HSP60にIgG1またはIgG2aのモノクローナル抗体を投与したマウスとしてHSP60またはいずれかのアイソタイプ対照mAbまたはPBS（図4）にIgG2bモノクローナル抗体を投与したマウスをコントロールと比較して有意に生存期間の延長を持っている。
- さらに、保護mAbを投与したマウスでは、7日目で肺と脾臓のCFUの数の大幅な削減があったと14日目（図5）で肺に酵母の数字の2と2.5対数単位の減少。
図1：H.の成長capsulatumとハイブリドーマ。 H.から得られた単一コロニーから（A）液体HAM F - 12培養の準備capsulatumは BHI血液寒天プレート上で増殖。 （B）蛋白質による細胞培養フラスコとモノクローナル抗体の精製のハイブリドーマの成長親和性のcromatographyを使用して、/ Gの樹脂。
図2：H.鼻腔内感染のcapsulatumの接種材料の準備。 H.後に得られた細胞懸濁液注射器や遠心分離によりcapsulatum凝集体の破壊を、血球計でカウントすることによって列挙されます。細胞濃度は<50μLの1.25 × 10 7（生存実験）または5 × 10 6（外装フィルム、サイトカインや組織）に調整されます。
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図3：モノクローナル抗体投与時のマウスの扱い。 （A）マウスは、尾部によって取得され、（BとC）theearsに近いとして、その首の首筋を保持することによって固定化されている。 （D）テールは、小指と手のひらの間に開催されます。 （E）抗体のソリューションは、26G1 / 2針を用いて注入されます。 （F）H. capsulatum接種を穏やかにナーレに細胞懸濁液をピペッティングにより鼻腔内に投与される。
図4：HSP60へのモノクローナル抗体はヒストプラズマ症の病因を変更することができます。 IgG1の500μgの、またはIgG2aモノクローナル抗体2時間前に感染症大幅に生存期間の延長に（P <0.05、対照と比較して）、しかしIgG2bモノクローナル抗体でIP注射。
図5：7〜14日目の肺のCFUの決定HSP60または無関係な抗体に選択されたモノクローナル抗体でIPを投与したマウスの5 × 10 6 Hcが酵母による致死鼻腔内チャレンジ後には、IgG1およびIgG2aのための真菌負担の減少は、処理された動物のモノクローナル抗体を示した。黒いバーは、7日目と白のバーでの外装フィルムの上から14日後に感染（* 7日間でp <0.001及び** P <0.001の14日後の感染で）を表す。
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Discussion
ここで紹介するプロトコールは、モノクローナル抗体がH.するということを示していますcapsulatumは、実験マウスヒストプラズマ症のコースを変更することができます。病原体の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体は、宿主と病原体の相互作用中に発生する複雑なダイナミクスを変更することができます。本研究では、腹腔内注射したときmAbが致死ヒストプラズマ症のマウスモデルにおける保護を仲介すること確立し、それはそのようなH2B、Mの抗原（カタラーゼ表面）（3）とHSP60などのワクチン開発のための候補タンパク質を、示唆している。 in vivoで、HcはHSP60とH2Bの保護mAbの投与は、臓器真菌負担と炎症や感染マウスの生存期間の延長を減少させた。
もののH.のためのワクチン開発彼らは必ずしも免疫応答を調整することができないためcapsulatumは研究の刺激的な領域である、予防接種は、免疫低下個体における、効果がない場合があります。したがって、この集団はH.するmAbを主に受動的な治療の恩恵を受ける可能性があることが明らかになりますcapsulatum抗原 。我々のデータは特にHSP60へまたは他のモノクローナル抗体との組み合わせで細胞表面抗原に対するmAbが、、ヒストプラズマ（4、6）患者の治療を改善できることを示唆している。 H.へのmAbのさらに、組み合わせ抗真菌薬療法によるcapsulatumは相乗と防御効果のより効果的にすることができます。アムホテリシンBは選択薬であり、通常はヒストプラズマ症の初期治療に使用されます。したがって、抗真菌薬の治療にモノクローナル抗体の添加は、今後の研究で考慮されるべきである。実際に、我々は以前にH2Bと私たちの動物モデルにおけるアムホテリシンBのサブ阻害濃度（5）へのモノクローナル抗体の相乗効果を実証している。さらに、mAbは、特に、ヒト免疫不全ウイルス感染またはTNF -α阻害薬を投与された患者を持つ個人として、リスクの高い人、に、ヒストプラズマ症の流行で予防的に投与することができます。保護mAbの将来の調査では、H.に対するヒストプラズマ症と抗体の機能の病因に追加の重要な洞察を明らかにすることがありますcapsulatumと、おそらく、他の細胞内の病原体。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
- Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
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