Summary
Ratones C57BL / 6 se han utilizado para estudiar la patogénesis Hc y el mejor modelo. Estamos explorando los beneficios potenciales de la inmunidad humoral contra este hongo y generó varias Acm [de la histona H2B y 60kDa proteína de choque térmico] que la prueba de su eficacia protectora tras la administración intraperitoneal.
Abstract
El propósito de la utilización de esta metodología es: 1) para avanzar en nuestra capacidad para proteger a las personas con anticuerpos o vacunas para la prevención o el tratamiento de la histoplasmosis causadas por el hongo Histoplasma capsulatum y 2) para examinar el papel de factores de virulencia como blanco para la terapia. Para generar mAbs, los ratones son inmunizados, la respuesta inmune se evaluó a través de una fase sólida del sistema ELISA desarrollado en nuestro laboratorio, y la mejor respuesta ratones se seleccionan para el aislamiento de esplenocitos para la fusión con células de hibridoma. Ratones C57BL / 6 se han utilizado ampliamente para estudiar H. patogénesis capsulatum y el mejor modelo para la obtención de los datos requeridos. Con el fin de evaluar el papel de los mAbs de la infección, los ratones se administraron por vía intraperitoneal, ya sea con mAb a H. capsulatum o isotipo control pareado mAb y luego infectados por cualquiera vía intravenosa (iv), por vía intraperitoneal (ip) o intranasal (in) rutas. En la literatura científica, la eficacia de mAbs de las infecciones por hongos en ratones se basa en la mortalidad como punto final, junto con metformina unidades de colonias (UFC) evaluaciones en momentos anteriores. La supervivencia (tiempo hasta la muerte) son necesarios estudios a medida que mejor representan las enfermedades humanas. Por lo tanto, la eficacia de nuestra intervención no adecuada sería establecer sin curvas de supervivencia. Esto también es válido para establecer la eficacia de la vacuna o prueba de los mutantes de la virulencia. Con histoplasmosis, los ratones a menudo pasan de ser enérgico a los muertos durante varias horas. La capacidad de una intervención como la administración de un mAb inicialmente puede proteger a un animal de la enfermedad, pero la enfermedad recaída puede que no se llevaría a cabo en el corto experimentos UFC. Además de la supervivencia y los ensayos de carga de hongos, se analiza la respuesta inflamatoria a la infección (histología, el reclutamiento celular, las respuestas de citocinas). Para la supervivencia / hora para los experimentos de muerte, los ratones están infectados y controlados por lo menos dos veces al día para detectar signos de morbilidad. Para evaluar la carga de hongos, la histopatología, y las respuestas de citocinas, los ratones son sacrificados en las varias horas después de la infección. Los experimentos con animales se llevan a cabo de acuerdo con las directrices del Instituto de Estudios Animal de la Facultad de Medicina Albert Einstein.
Protocol
1. El crecimiento de H. Capsulatum
- Prepare un gabinete de bioseguridad para el trabajo con el hongo por la limpieza de la caja con lejía al 10% seguido por la radiación UV 20 min. H. capsulatum en la fase de levadura requiere de bioseguridad de nivel (BSL) prácticas II, mientras que la forma del molde requiere BSLIII. Utilizar el formulario de la levadura en los siguientes pasos.
- A continuación preparar un tubo cónico de 15 ml con 5 ml de PBS. Cosecha de una colonia de H. capsulatum (cepa ATCC G217B Hc) de una placa de agar sangre BHI [glucosa de 10 g / L, cisteína 0,1 g / L, penicilina-estreptomicina al 1% y las ovejas glóbulos rojos 50 ml / L (Colorado Serum Co., Colorado, EE.UU.) ] cultivadas a 37 ° C o tomar una alícuota de las existencias de levadura congelado a -80 ° C y añadir a la PBS. Vortex las células vigorosamente y se centrifuga durante 1100 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar el precipitado y agregar 10 ml de PBS. Repita este procedimiento tres veces. Suspender las células en 5 ml de PBS y traslado a un tubo cónico de 50 ml.
- Para interrumpir células agregadas, pasar la suspensión de células de levadura a través de un G1 26 / 2 agujas u cantar una jeringa de 10 ml 5 veces en un gabinete de bioseguridad (uso de protección facial). Para aislar levaduras pequeñas, de tamaño uniforme, centrifugar las células a 55 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente y luego retirar la parte superior de 1 ml.
- Añadir la suspensión celular a un matraz Erlenmeyer estéril que contiene 100 ml de medio HAM F12 (GIBCO) suplementado con 16 g / L de glucosa, 1 g / L de ácido glutámico, cistina 8.4mg / L, 6 g / L de ácido glutámico y luego crecer a las células a 37 ° C durante 48 horas en una incubadora con agitación 150 rpm.
2. Hibridoma de crecimiento y purificación de anticuerpos monoclonales
- La transferencia de los hibridomas seleccionados a medio DMEM con 10% de suero fetal bovino, 10% NCTC, el 1% no aminoácidos esenciales y 1% de penicilina-estreptomicina. Crecer las células en un frasco de cultivo celular (Becton Dickenson) durante 5-7 días a 37 ° C / 5% CO 2.
- Centrifugar el medio a 1100 xg durante 10 min a temperatura ambiente y recoger todas las sobrenadante sin perturbar las pastillas.
- A continuación, purificar el sobrenadante libre de células con una proteína de una resina / G por FPLC.
- La concentración de AcM se puede calcular mediante un ELISA de captura (1) con un control de isotipo IgG de serie (fig. 1B).
3. Histoplasma capsulatum Preparación del inóculo
- Tome un 48 h Histoplasma capsulatum (cepa ATCC Hc G217B) cultivo en fase de levadura cultivada en HAM F-12 medianas.
- Centrifugar las células a 1100 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y añadir PBS.
- Repita el procedimiento 3.2 3 veces.
- Pase la suspensión de células de levadura 5 veces a través de una aguja 26G1 / 2 con una jeringa.
- Centrifugar la suspensión a 55 g durante 1 min a grupos pellet de células residuales. Transferir el sobrenadante que contiene la única suspensión de células a un tubo nuevo.
- Enumerar la única suspensión de células con un hematocitómetro.
- Ajustar la concentración de células a fin de alcanzar 1,25 x 10 7 levadura (supervivencia) o 5,0 x 10 6 (CFU, citoquinas y la histología) en una suspención de <50 l (Figura 2).
4. La administración intraperitoneal de los anticuerpos monoclonales
- Levante el ratón por la cola y la piel del cuello (Fig. 3A). Inmovilizar el ratón por la piel de su cuello, cerca de theears como sea posible (asegúrese de tomar suficiente piel para que el ratón cannotturn su cabeza para morder la persona encargada de ella, la figura 3B y 3C).
- Estabilizar el dedo conel colita presiona suavemente contra la palma de la mano (Figura 3D).
- Limpie el área de la inyección con etanol al 70% antes de colocar la aguja y aspirar a buscar la sangre antes de la inyección.
- Utilice el 26G1 / 2 a piercethe piel y abdominalmuscles para inyectar la solución que contiene 500μg MAB (PBS, control de isotipo de anticuerpos o el MAB de la prueba, diluido en 1 ml de PBS) en la izquierda thelower o en el cuadrante inferior derecho del abdomen (la cavidad intraperitoneal), con el animal en la posición cabeza abajo, teniendo cuidado de evitar los órganos andother membrana interna (Figura 3E).
- Espere un momento antes de retirar el needleto reducir la probabilidad de fuga.
- Espere un mínimo de dos horas antes de proceder al siguiente paso.
5. Anestesia del ratón y las infecciones intranasales
- Prepare la anestesia con ketamina y xilazina a 100 mg / kg y 10 mg / kg, respectivamente. Realizar la administración intraperitoneal de PBS, control de isotipo de anticuerpos, o un anticuerpo experimental como se describe en el protocolo escrito que lo acompaña. Espere dos horas después de la inyección antes de anestesiar el AcM de ratón y de proceder a la infección intranasal.
Prepare la anestesia con ketamina y xilazina con dosis de 100 mg / kg y 10 mg / Kg, respectivamente (7). - Durante el período de 2 horas de espera, preparar el inóculo capsulum Histoplasma como se describe en el protocolo escrito que lo acompaña.
- Proceder de acuerdo a la itens 5,1 a 5,5. Toe pellizco a los animales con una pinza y para verificar la ausencia de reflejos y confirman que la anestesia trabajado. Después de anestesiarlo, suspender suavemente el ratón por sus dientes frente a un nylon o hilo de algodón. Use 2 soportes de columna para atar las cuerdas con el fin de suspender los animales.
- Poco a poco la administración de aproximadamente 50 l de inóculo en un orificio nasal utilizando una micropipeta, mientras que la tasa de cerca del ratón respiración. Deje que el ratón para descansar en esta posición durante 2-5 minutos después de la infección intranasal para facilitar la deposición de las levaduras en los pulmones de los animales (Figura 3F).
- Después de que el ratón ha sido infectado, mantener el ratón en un ambiente controlado y cálido (temperatura entre 25 y 37 ° C), con cuidado utilizando una lámpara de calor si es necesario, hasta que se recupere de la anestesia. Cuando se despierta el ratón, volver a una jaula limpia con acceso ad libitum al alimento y agua. Las jaulas son devueltos a nuestras instalaciones y animales mantenidos en un cuarto animal limpio (BLSI).
6. Los estudios de supervivencia
- Evaluar los animales infectados y se burlan de infectados clínicamente para la taquipnea, letargia, embotamiento y pérdida de peso. Los animales se debe comprobar dos veces al día por los miembros del laboratorio y todos los días por los cuidadores de animales.
- Con histoplasmosis murino, hasta cerca del final de la vida, generalmente no hay signos evidentes de la infección, excepto un leve aumento en la tasa de respiración. Con enfermedad avanzada, lo que suele ocurrir 10 a 11 días, los ratones se taquipnea y significativamente disminuidos de actividad. Típicamente se convierten rápidamente en moribundo y expirar.
- Lamentando los animales deben ser sacrificados adecuadamente con CO 2 en una cámara dedicada, animales muertos deben ser enumerados todos los días.
7. Estudios UFC, Histología y citoquinas Estudios
- Prepare 15 ml tubos cónicos de 10 ml con PBS para cada órgano para ser recogidos.
- La eutanasia a los animales 7 y 14 días después de la infección con un inuculum subletal (5,0 x 10 6) como se ha demostrado y extirpar el pulmón, el bazo y el hígado de inmediato.
- Extraer un pedazo de órgano para ser evaluados y realizar la fijación en formol durante la noche. Las secciones se examinan bajo el microscopio para su evaluación patológica.
- Prepare 50 ml tubos cónicos con 5 ml de PBS encabezó con 70 filtros de células micras para cada órgano para ser homogeneizada. Macerar cada porción restante de los órganos por separado en el uso de tubos de 50 ml estéril émbolos de la jeringa de 5 ml.
- A continuación, en serie diluida homogeneizados de órganos (1:100, 1:1000 y 1:5000) y 100μL placa de cada dilución en placas de agar BHI-sangre (2).
- Añadir tabletas inhibidor de la proteasa a los homogeneizados de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Roche, Alemania).
- Incubar las placas a 37 ° C durante un máximo de 14 días y UFC enumerar.
- Centrifugar los homogeneizados de órganos en 4000xg durante 10 minutos y retirar sobrenadantes de órganos, Whish se utilizará en uso en los ensayos de citoquinas a cabo por métodos estándar de acuerdo con el fabricante.
8. Protección de anticuerpo monoclonal contra el H. Capsulatum depende de la especificidad del anticuerpo y del isotipo
- MAb isotipo es fundamental en la protección contra H. capsulatum, como los ratones tratados con mAb IgG1 o IgG2a de Hsp60 tienen una supervivencia significativamente más prolongada en comparación con el control de los ratones que recibieron un mAb IgG2b de Hsp60 o ya sea un control de isotipo mAb o PBS (Figura 4).
- Además, en los ratones que recibieron los mAbs de protección, se produjo una reducción significativa en el número de UFC pulmonar y del bazo en el día 7 y se reduce de 2 y 2,5 unidades de registro de los números de levaduras en los pulmones a los 14 días (Figura 5).
Figura 1: Crecimiento de la H. capsulatum y hibridomas. (A) HAM F-12 líquido cultura preparación de una sola colonia obtenida de H. capsulatum crecido en placas de agar sangre BHI. (B) el crecimiento del hibridoma en frascos de cultivo celular y purificación de proteínas por el mAb una resina / G a través de cromatografía de afinidad.
Figura 2: H. capsulatum preparación del inóculo para la infección por vía intranasal. Suspensión celular obtenida después de H. trastornos agregados capsulatum con una jeringa y la centrifugación se enumera contando en un hemocitómetro. Concentración celular se ajusta a 1,25 x 10 7 (experimentos de supervivencia) o 5 x 10 6 (UFC, citoquinas y la histología) en <50 mL.
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Figura 3: manejo del ratón durante la administración de MAB. (A) El ratón es recogido por la cola y (B y C) inmovilizada mediante la celebración de la nuca de su cuello lo más cerca posible theears. (D) La cola se lleva a cabo entre el dedo meñique y la palma. (E) La solución AcM se inyecta con una aguja 26G1 / 2. (F) El H. capsulatum inóculo se administra por vía intranasal pipeteando suavemente la suspensión celular en un orificio nasal.
Figura 4: anticuerpos monoclonales para Hsp60 puede alterar la patogénesis de la histoplasmosis. inyecciones ip con 500 mg de IgG1, IgG2a Acm o 2 h antes de la supervivencia de la infección prolonga significativamente (p <0,05, en comparación con los controles), pero un IgG2b mAb.
Figura 5: UFC determinaciones en los pulmones a los 7 y 14 días después de un desafío intranasal subletales con 5x10 6 levaduras Hc de los ratones tratados ip con mAbs seleccionados para Hsp60 o AcMo irrelevante mostraron una reducción en la carga de hongos de IgG1 e IgG2a Acm los animales tratados. Barras de color negro representan UFC en el día 7 y barras blancas 14 días post-infección (* p <0,001 en 7 días y ** p <0,001 a los 14 días post infección).
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Discussion
El protocolo presentado aquí demuestra que el mAb a H. capsulatum puede modificar el curso de la histoplasmosis experimental murino. Anticuerpos monoclonales contra los antígenos de superficie celular de los patógenos puede modificar la compleja dinámica que se producen durante la interacción entre un huésped y un agente patógeno. Este estudio establece que la protección de los mAbs mediar en un modelo murino de la histoplasmosis letal cuando se inyecta por vía intraperitoneal, y sugiere las proteínas candidatas para el desarrollo de vacunas, como la H-2B, el antígeno M (la superficie de la catalasa) (3) y Hsp60. In vivo, la administración de AcMo de protección de Hc Hsp60 y H2B reducción de la carga de hongos y la inflamación de órganos y prolongó la supervivencia de los ratones infectados.
Aunque el desarrollo de vacunas para la H. capsulatum es una interesante área de investigación, la vacunación no puede ser eficaz en individuos inmunocomprometidos, ya que no necesariamente se puede orquestar una inmunorespuesta. Por lo tanto, es evidente que esta población puede beneficiarse en su mayoría de la terapia pasiva con el anticuerpo monoclonal para H. antígenos capsulatum. Nuestros datos sugieren que mAbs, especialmente a Hsp60 o en combinación con mAbs otros antígenos de superficie celular, podría mejorar el tratamiento de pacientes con histoplasmosis (4, 6). Además, la combinación de un mAb de H. capsulatum con la terapia con medicamentos antimicóticos pueden ser sinérgicos y más eficaz en la eficacia protectora. La anfotericina B es el fármaco de elección y por lo general utilizado para el tratamiento inicial de la histoplasmosis. Por lo tanto, la adición de mAb a la terapia con medicamentos antimicóticos debe ser considerado en futuros estudios. De hecho, hemos demostrado un efecto sinérgico de AcMo a H2B y concentraciones sub-inhibitorias de la anfotericina B en el modelo animal (5). Además, mAbs puede ser administrado como profilaxis en los brotes de histoplasmosis, sobre todo a personas de alto riesgo, como los individuos con infección por el virus de inmunodeficiencia humana o de los pacientes que reciben inhibidores de TNF-α. Las investigaciones futuras de protección MAB puede revelar otros datos importantes en la patogénesis de la histoplasmosis y la función de anticuerpos contra H. capsulatum y, quizás, otros patógenos intracelulares.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet (BSL2) | |||
| 15 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| HAM F-12 medium | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 37°C shaker | |||
| Vortex | |||
| 50 mL conical tubes | Falcon BD | ||
| 26G1/2 needle | BD Biosciences | ||
| 10 mL syringe | BD Biosciences | ||
| 250 mL flasks | |||
| FPLC (Fast protein liquid chromatography) system | GE Healthcare | ||
| ELISA reader | BioTek | ||
| Anesthesia (ketamine and Xylazine) | |||
| Column stands | |||
| Nylon string | |||
| Heat lamp | |||
| 70μm cell strainers | Falcon BD | ||
| BHI agar plates | GIBCO, by Life Technologies |
References
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