Isolatie en Cultuur van Cellen van de nefrogene Zone van de embryonale Mouse Kidney

Summary

In dit rapport beschrijven we een methode voor de isolatie en de cultuur van de progenitor cel niche van de embryonale muis nier die gebruikt kan worden om signaalwegen reguleren van stam / voorlopercellen van de zich ontwikkelende nier te bestuderen. Deze gekweekte cellen zijn zeer toegankelijk is voor kleine moleculen en recombinant eiwit behandeling, en vooral ook om virale transductie, die een efficiënte manipulatie van de kandidaat-wegen mogelijk maakt.

Abstract

Embryonale ontwikkeling van de nier is reeds uitgebreid bestudeerd, zowel als een model voor epitheliale-mesenchymale interactie in organogenese en om begrip van de oorsprong van aangeboren nierziekte te krijgen. Meer recent heeft de mogelijkheid van sturing naïeve embryonale stamcellen in de richting van nefrogene lot onderzocht in de opkomende gebied van de regeneratieve geneeskunde. Genetische studies in de muis hebben een aantal wegen die nodig zijn voor nier-ontwikkeling, en een globale catalogus van gentranscriptie in het orgel is onlangs gegenereerd http://www.gudmap.org/ , het verstrekken van een groot aantal kandidaat-regulatoren van essentiële ontwikkeling functies. Organogenese van het knaagdieren nier kan worden bestudeerd in orgelcultuur, en vele rapporten hebben gebruik gemaakt van deze aanpak om de resultaten te analyseren van een van beide het toepassen van de kandidaat-eiwitten of slopen van de expressie van genen met behulp van siRNA of morpholinos. Echter, is de toepasselijkheid van de orgelcultuur op de studie van signalering die stam / voorlopercellen celdifferentiatie versus vernieuwing regelt in de ontwikkelingslanden nier beperkt gekweekte organen bevatten een compacte extracellulaire matrix het beperken van de verspreiding van macromoleculen en virusdeeltjes. Naar de cel signaleren gebeurtenissen die de stam / voorlopercellen cell niche in de nieren hebben we een primaire cel systeem dat de nefrogene zone of stamceltransplantatie niche van de zich ontwikkelende nier ex vivo los van de epitheliale inductor van differentiatie stelt invloed te bestuderen. Met behulp van beperkte enzymatische vertering, kan nefrogene zone cellen worden selectief bevrijd van de ontwikkeling van de nieren bij E17.5. Na filtratie, kunnen deze cellen worden gekweekt als een onregelmatige monolaag met behulp van optimale condities. Markergen analyse toont aan dat deze culturen een verdeling van celtypen kenmerk van de nefrogene zone in vivo bevatten, en dat ze te onderhouden bijbehorende markering genexpressie tijdens de cultuur periode. Deze cellen zijn zeer toegankelijk is voor kleine moleculen en recombinant eiwit behandeling, en vooral ook om virale transductie, die sterk vergemakkelijkt de studie van de kandidaat-stam / voorlopercellen cel regulator effecten. Fundamentele celbiologische parameters zoals proliferatie en celdood, alsook veranderingen in de expressie van moleculaire merkers kenmerk van nefron stam / voorlopercellen cellen in vivo kunnen succesvol gebruikt worden als experimentele resultaten. De lopende werkzaamheden in ons laboratorium het gebruik van deze nieuwe primaire cel techniek heeft tot doel te ontdekken basis mechanismen voor de regulatie van zelfvernieuwing versus differentiatie in nefron stam / progenitorcellen.

Protocol

1. Voorbereiden Reagentia voor Kidney spijsvertering 1,5 ml van 0,25% Collagenase A (w / v) en 1% Pancreatine verteren (w / v) oplossing nodig zullen zijn voor de winning van nefrogene zone cellen (NZCs) vanaf 8 E17.5 nieren. Omdat Pancreatine duurt ongeveer 2 uur om op te lossen bij kamertemperatuur, voldoende verteren oplossing voor het grootste aantal van embryonale nieren verwachting dient voorafgaand aan het experiment worden gemaakt. Bereid verteren oplossing door eerst toevoeging van 25 mg Collagenase …

Discussion

In dit protocol beschrijven we een methode om te isoleren en cultuur cellen uit de nefrogene zone van de embryonale nier. Het is de ontwikkeling van een methode in eerste instantie gepubliceerd als onderdeel van een studie van de effecten van BMP7 behandeling op de cellen van de nefrogene zone (Blank et al.., 2009). In de eerste studie werden een reeks experimenten om de cel te typen vertegenwoordigd in de NZC populatie karakteriseren uitgevoerd. Kortom, zuivering van NZCs van genetische verslaggevers voor de c…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Watchmaker’s forceps #5		Roboz	RS-4905	2 pairs required
Collagenase A		Roche	10 103 578 001	Wear mask
Porcine Pancreatin		Sigma	P8096	Wear mask
DPBS w/ Ca, Mg		Lonza	17-513F	With Mg & Ca
Fetal bovine serum (FBS)		BioWhittaker	14-901E
HBSS		Gibco	14175
KSFM		Gibco	10724-011	without added growth factors
L-Glutamine 200mM		Sigma	G7513	Use @ 1% v/v
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml		Sigma	P4333	Use @ 1% v/v
Fibronectin		BD Biosciences	356008	Supplied as powder
24 well culture plate		Thermo Scientific	142485	Nunclon
DPBS w/o Mg & Ca		Lonza	17-512F
5mL polystyrene tubes		BD Biosciences	352235
DNase (1 U/μl)		Invitrogen	18068-015	4 μl per 1.5 ml
40 micron cell-strainer		BD Biosciences	352235	w/cap and tube
Paraformaldehyde		Sigma	P6148	Use @ 4 % w/v
Triton X100		VWR	VW3929-2	Use @ 0.3 % v/v
PBS		Sigma	P3813	Supplied as powder
Donkey serum		Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Use @ 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2		Invitrogen	71-6000	Dilute 1:100
Rabbit anti-β-gal		MP Biomedicals	559762	Dilute 1:200
Oregon Green 488 phalloidin		Invitrogen	O7466	Dilute 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568		Invitrogen	A10042	Dilute 1:200
DAPI		Invitrogen	D1306	Dilute 1:5000
Vectashield		Vector Laboratories	H-1000
Glycerol		EMD	GX0185-6	Mix 50 % with H2O
RNeasy Micro Kit		Qiagen	74004	Use “DNase on column” protocol
Transfer pipettes, 3ml		BD Falcon	357575