マウス胎児の腎臓の腎性帯からの細胞の単離と培養
Summary
本報告書では、発展途上腎臓の幹細胞/前駆細胞を調節するシグナル伝達経路を研究するために使用できるマウス胎児の腎臓から前駆細胞のニッチの分離と培養のための方法を説明します。これらの培養細胞は、候補の経路の効率的な操作を可能にする、小分子および組換えタンパク質の治療に、そして重要なことは、ウイルス形質導入に非常にアクセス可能です。
Abstract
腎臓の胚発生は広範囲に器官形成における上皮 – 間葉相互作用のモデルとして、先天性腎臓病の起源の理解を得るために両方が検討されている。さらに最近では、腎性運命に向かってナイーブな胚性幹細胞をステアリングの可能性は、再生医療の新たな分野で検討されている。マウスの遺伝学的研究は、腎臓の開発に必要ないくつかの経路を同定し、そして臓器における遺伝子転写のグローバルカタログは最近生成されてhttp://www.gudmap.org/~~V 、本質的な発達機能の多数の候補のレギュレータを提供しています。げっ歯類の腎臓の器官形成は、器官培養で検討することができる、と多くの報告は、どちらかの候補タンパク質を適用したり、siRNAまたはモルフォを使用して候補遺伝子の発現をノックダウンの成果を分析するためにこのアプローチを使用している。培養臓器が巨大分子及びウイルス粒子の拡散を制限するコンパクトな細胞外マトリックスを含んでいるのでしかし、発展途上腎臓における幹細胞/前駆細胞の分化に対する更新を制御するシグナル伝達の研究に器官培養の適用性が制限されています。腎臓に幹細胞/前駆細胞のニッチに影響を与えるイベントを細胞シグナル伝達を研究するために我々は、分化の上皮誘導因子から独立して開発する腎臓のex vivoでの腎性ゾーンまたは前駆細胞のニッチを確立する主要な細胞システムを開発した。制限酵素消化を用いて、腎性ゾーンの細胞はE17.5で腎臓の開発と選択的に解放することができます。ろ過に続いて、これらの細胞は最適化された条件を使用して不規則な単層として培養することができる。マーカー遺伝子の解析は、これらの培養物は、in vivoでの腎性ゾーンの特性の細胞型の分布を含んでいること、そして彼らは培養期間中に適切なマーカー遺伝子の発現を維持することを示している。これらの細胞は、小分子および組換えタンパク質の治療に、そして重要なことにも大いに候補幹細胞/前駆細胞の調節効果の研究を容易にウイルスの伝達、に非常にアクセス可能です。このような増殖と細胞死だけでなく、in vivoでのネフロンの幹細胞/前駆細胞の特徴的分子マーカーの発現の変化などの基本的な細胞生物学的パラメータは正常に実験的な成果として使用することができます。この小説の主細胞技術を用いて、我々の研究室で進行中の作業は、ネフロンの幹細胞/前駆細胞の自己再生対分化の調節を支配する基本的なメカニズムを解明することを目指しています。
Protocol
Discussion
このプロトコルでは、胚性腎臓の腎性ゾーンから細胞を単離、培養する方法を説明します。それは最初に腎性ゾーン（ブランクら 、2009）の細胞へのBMP7治療の効果の研究の一環として公表された方法の開発である。初期の研究では、NZC人口の中で表されるセルのタイプを特徴づけるために一連の実験を行った。 （のSrinivas ら、2001; Yu らを 、簡単に言えば、皮質の間質?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIDDK（LO）、アメリカ心臓協会（AB）、スウェーデンとKungliga Fysiografiska Sällskapet、ルンド、スウェーデン（UB）のウェナーグレングレン基礎からポスドクからR01 DK078161によってサポートされていました。追加のサポートは、病理組織学、バイオインフォマティクスおよびFACS用メイン医療センター研究所の中核施設（2P20RR18789 – 06でサポートされている）とMMCRIの動物施設で提供されていました。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz | RS-4905 | 2 pairs required | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 578 001 | Wear mask | |
| Porcine Pancreatin | Sigma | P8096 | Wear mask | |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza | 17-513F | With Mg & Ca | |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | ||
| HBSS | Gibco | 14175 | ||
| KSFM | Gibco | 10724-011 | without added growth factors | |
| L-Glutamine 200mM | Sigma | G7513 | Use @ 1% v/v | |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma | P4333 | Use @ 1% v/v | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder | |
| 24 well culture plate | Thermo Scientific | 142485 | Nunclon | |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza | 17-512F | ||
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | ||
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml | |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Use @ 4 % w/v | |
| Triton X100 | VWR | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v | |
| PBS | Sigma | P3813 | Supplied as powder | |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v | |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 | |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 | |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Glycerol | EMD | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use “DNase on column” protocol | |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Falcon | 357575 |
Riferimenti
- Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development. 136, 3557-3566 (2009).
- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution. Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).
- Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. Regulation of BMP7 expression during kidney development. Development. 125, 3473-3482 (1998).
- Grobstein, C. Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse. Science. 118, 52-55 (1953).
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- Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population. Development. 131, 4593-4605 (2004).
- Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).
- Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129, 5301-5312 (2002).
