בדו"ח זה אנו מתארים שיטה לבידוד והתרבות של נישה הקדמון התא הכליות עכבר עובריים שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד מסלולי איתות ויסות גזע / ובתאים של הכליה המתפתחת. אלו תאים בתרבית נגישים מאוד מולקולה קטנה וטיפול חלבון רקומביננטי, והוא חשוב גם התמרה ויראלית, המאפשרת מניפולציה יעילה של המסלולים מועמד.
ההתפתחות העוברית של הכליה, נחקרה בהרחבה הן כמודל עבור אינטראקציה אפיתל-mesenchymal ב organogenesis ולקבל בהבנה את מקורותיה של מחלת כליות מולדת. לאחרונה, האפשרות של היגוי נאיבי בתאי גזע עובריים כלפי גורלם nephrogenic נחקר בתחום המתפתח של רפואה רגנרטיבית. מחקרים גנטיים בעכברים זיהו מסלולים מספר הדרושים לפיתוח כליות, קטלוג עולמי של שעתוק הגנים באיבר לאחרונה שנוצר http://www.gudmap.org/ , מתן הרגולטורים מועמד רבים של פונקציות התפתחותי חיוני. Organogenesis של הכליה מכרסם ניתן ללמוד בתרבות איברים, ודוחות רבים השתמשו בגישה זו כדי לנתח את התוצאות של יישום או חלבונים מועמד או מפילה את הביטוי של גנים מועמדים באמצעות siRNA או morpholinos. עם זאת, תחולתה של התרבות איבר ללימוד איתות המווסת גזע / תא אב בידול מול חידוש בכליות פיתוח מוגבלת איברים בתרבית מכילים דיפוזיה קומפקטי תאי מטריקס מגבילים של מקרומולקולות חלקיקי הנגיף. כדי לחקור את תא האיתות אירועים המשפיעים על גזע / תא נישה אבי בכליות פיתחנו מערכת תא העיקרי קובע את אזור nephrogenic או תא נישה ובתאים של vivo פיתוח כליה לשעבר במנותק inducer אפיתל של בידול. באמצעות עיכול אנזימטי מוגבל, תאים אזור nephrogenic יכול להיות משוחרר באופן סלקטיבי מלפתח הכליות ב E17.5. לאחר סינון, התאים האלה יכול להיות מתורבת כמו monolayer סדיר באמצעות תנאים אופטימיזציה. הגן ניתוח מרקר מוכיח כי תרבויות אלה מכילים חלוקה של סוגי תאים האופייניים לאזור nephrogenic in vivo, וכי הם שומרים על ביטוי הגן המתאים סמן בתקופת התרבות. תאים אלה הם נגישים מאוד מולקולה קטנה וטיפול חלבון רקומביננטי, והוא חשוב גם התמרה ויראלית, אשר מאוד מקלה את המחקר של גזע / אבי מועמד תופעות תא הרגולטור. הפרמטרים של תא ביולוגי בסיסי כגון התפשטות מוות של תאים, כמו גם שינויים בביטוי של סמנים מולקולריים האופייניים נפרון גזע / ובתאים in vivo יכול לשמש בהצלחה גם תוצאות הניסוי. העבודה השוטפת במעבדה שלנו באמצעות טכניקה זו הרומן תא ראשוני שמטרתו לחשוף את המנגנונים הבסיסיים הקובעים את הרגולציה של התחדשות עצמית לעומת הבחנה נפרון גזע / ובתאים.
בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לבודד והתרבות תאים מאזור nephrogenic של הכליה העוברית. זהו פיתוח של שיטת שפורסם בתחילה כחלק ממחקר של ההשפעות של טיפול BMP7 על תאים של אזור nephrogenic (בלנק et al. 2009). במחקר הראשוני, בסדרה של ניסויים כדי לאפיין את סוגי תאים מיוצג בקרב האוכלוסייה NZC נע…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי R01 DK078161 מ NIDDK (LO), מלגות דוקטורט של איגוד הלב האמריקני (AB), ונר-גרן יסודות שוודיה Kungliga Fysiografiska Sällskapet, לונד, שבדיה (UB). תמיכה נוספת סופק על ידי המרכז הרפואי במיין מתקני המכון לחקר הליבה Histopathology, ביואינפורמטיקה FACS (נתמך על ידי 2P20RR18789-06) ואת מתקן בעלי חיים MMCRI.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Watchmaker’s forceps #5 | Roboz | RS-4905 | 2 pairs required | |
Collagenase A | Roche | 10 103 578 001 | Wear mask | |
Porcine Pancreatin | Sigma | P8096 | Wear mask | |
DPBS w/ Ca, Mg | Lonza | 17-513F | With Mg & Ca | |
Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | ||
HBSS | Gibco | 14175 | ||
KSFM | Gibco | 10724-011 | without added growth factors | |
L-Glutamine 200mM | Sigma | G7513 | Use @ 1% v/v | |
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma | P4333 | Use @ 1% v/v | |
Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder | |
24 well culture plate | Thermo Scientific | 142485 | Nunclon | |
DPBS w/o Mg & Ca | Lonza | 17-512F | ||
5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | ||
DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml | |
40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Use @ 4 % w/v | |
Triton X100 | VWR | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v | |
PBS | Sigma | P3813 | Supplied as powder | |
Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v | |
Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 | |
Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 | |
Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 | |
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
Glycerol | EMD | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O | |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use “DNase on column” protocol | |
Transfer pipettes, 3ml | BD Falcon | 357575 |