Isolering och odling av celler från Nefrogen Zonen av embryonala Mouse Kidney

Summary

I denna rapport beskriver vi en metod för isolering och odling av stamceller nisch från embryonala musen njuren som kan användas för att studera signalvägar som reglerar stamceller / progenitorceller av utvecklingsländerna njure. Dessa odlade celler är mycket tillgänglig för små molekyler och rekombinant protein behandling och viktigare även för viral transduktion, som möjliggör en effektiv hantering av kandidat vägar.

Abstract

Embryonala utvecklingen i njuren har studerats både som en modell för epitelceller-mesenkymala interaktion i organogenesen och få förståelse för ursprunget av medfödd njursjukdom. På senare tid har möjligheten att styra naiva embryonala stamceller mot nefrogen öden varit utforskas i det framväxande området regenerativ medicin. Genetiska studier på mus har identifierat flera vägar som krävs för njure utveckling, och en global katalog över gentranskription i orgeln har nyligen skapats http://www.gudmap.org/ , vilket ger många kandidat regulatorer av viktiga utvecklings-funktioner. Organbildande av gnagare njuren kan studeras i orgel kultur, och många rapporter har använt denna metod för att analysera resultaten av antingen tillämpa kandidat proteiner eller knacka ner uttrycket av gener med hjälp av siRNA eller morpholinos. Dock är tillämpningen av orgeln kultur för studier av signalering som reglerar stamceller / stamceller differentiering kontra förnyelse i utvecklingsländerna njure begränsad odlade organ innehåller en kompakt extracellulärmatrix att begränsa spridningen av makromolekyler och partiklar virus. För att studera cellsignalering händelser som påverkar stammen / stamcellstransplantation nisch i njuren har vi utvecklat en primär cell system som fastställer nefrogen zonen eller stamcellstransplantation nisch av utvecklingsländerna njure ex vivo i isolering från epiteliala inducerare av differentiering. Använda begränsat enzymatisk spjälkning kan nefrogen zon celler selektivt befrias från att utveckla njurarna vid E17.5. Efter filtrering kan dessa celler odlas som en oregelbunden cellslager använda optimerade förhållanden. Markörgen analys visar att dessa kulturer innehåller en fördelning av celltyper kännetecknande för nefrogen zonen in vivo, och att de upprätthåller lämpliga uttryck markörgen under kultur perioden. Dessa celler är mycket tillgänglig för små molekyler och rekombinant protein behandling och viktigare även för viral transduktion, vilket avsevärt underlättar studier av kandidat stam / progenitorceller effekter cell regulator. Grundläggande cell biologiska parametrar såsom proliferation och celldöd samt förändringar i uttryck av molekylära markörer kännetecknar nephron stam / progenitorceller in vivo kan med fördel användas som experimentella resultat. Pågående arbete i vårt laboratorium med hjälp av denna roman primärcell teknik syftar till att avslöja grundläggande mekanismer som styr regleringen av självförnyelse kontra differentiering nefronet stam / progenitorceller.

Protocol

1. Förbereda Reagens för Njure Digestion 1,5 ml 0,25% kollagenas A (w / v) och 1% Pankreatin smälta (w / v) lösning kommer att behövas för utvinning av nefrogen zon celler (NZCs) från 8 E17.5 njurarna. Eftersom Pankreatin tar ca 2 timmar att lösa upp i rumstemperatur, nog smälta lösning för det största antalet embryon njurar förväntas göras före experimentet. Förbered smälta lösning genom att först lägga 25 mg kollagenas A till 10 ml Dulbecco är Fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) i en tyd…

Discussion

I detta protokoll beskriver vi en metod för att isolera och odla celler från nefrogen zon av embryonala njure. Det är utvecklingen av en metod som ursprungligen publicerades som en del av en studie av effekterna av BMP7 behandling på cellerna i nefrogen zonen (Blank et al., 2009). I den första studien var en serie experiment för att karakterisera celltyperna representerade inom NZC befolkningen genomförts. Kortfattat, rening av NZCs från genetiska reportrar för kortikala stroma (Foxd1 ^{+ / lacZ…}

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Watchmaker’s forceps #5		Roboz	RS-4905	2 pairs required
Collagenase A		Roche	10 103 578 001	Wear mask
Porcine Pancreatin		Sigma	P8096	Wear mask
DPBS w/ Ca, Mg		Lonza	17-513F	With Mg & Ca
Fetal bovine serum (FBS)		BioWhittaker	14-901E
HBSS		Gibco	14175
KSFM		Gibco	10724-011	without added growth factors
L-Glutamine 200mM		Sigma	G7513	Use @ 1% v/v
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml		Sigma	P4333	Use @ 1% v/v
Fibronectin		BD Biosciences	356008	Supplied as powder
24 well culture plate		Thermo Scientific	142485	Nunclon
DPBS w/o Mg & Ca		Lonza	17-512F
5mL polystyrene tubes		BD Biosciences	352235
DNase (1 U/μl)		Invitrogen	18068-015	4 μl per 1.5 ml
40 micron cell-strainer		BD Biosciences	352235	w/cap and tube
Paraformaldehyde		Sigma	P6148	Use @ 4 % w/v
Triton X100		VWR	VW3929-2	Use @ 0.3 % v/v
PBS		Sigma	P3813	Supplied as powder
Donkey serum		Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Use @ 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2		Invitrogen	71-6000	Dilute 1:100
Rabbit anti-β-gal		MP Biomedicals	559762	Dilute 1:200
Oregon Green 488 phalloidin		Invitrogen	O7466	Dilute 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568		Invitrogen	A10042	Dilute 1:200
DAPI		Invitrogen	D1306	Dilute 1:5000
Vectashield		Vector Laboratories	H-1000
Glycerol		EMD	GX0185-6	Mix 50 % with H2O
RNeasy Micro Kit		Qiagen	74004	Use “DNase on column” protocol
Transfer pipettes, 3ml		BD Falcon	357575