Summary
我们讨论一个复杂的非线性光学系统，采用超快全光开关，隔离荧光信号的拉曼的建设和运营。使用这个系统，我们能够成功地分离的拉曼光谱和荧光信号，利用脉冲能量和平均的权力，保持生物安全。
Abstract
拉曼光谱仪是常常困扰着一个强烈的荧光背景，特别是对生物样品。如果样品是兴奋的超短脉冲，一个系统，可以暂时分离频谱重叠信号皮秒时间尺度可以隔离的火车，及时到达迟到荧光光的拉曼散射光。在这里，我们讨论一个复杂的非线性光学系统，采用全光开关在一个低功率光学克尔门的形式，隔离拉曼光谱和荧光信号的建设和运营。一个单一的808 nm的激光2.4 W的平均功率和80 MHz的重复率是分裂的，与约200毫瓦808纳米的光被转换为<5兆瓦404 nm的光发送到的样本，以激发拉曼散射。其余未转换的808纳米的光，然后发送到非线性介质泵全光快门行为。快门打开和关闭了约5％的峰值效率在800 FS。使用这个系统，我们能够成功地分离拉曼光谱和荧光信号，在80 MHz的重复使用的脉冲能量和平均的权力，保持生物安全。由于该系统具有光功率没有余力，我们几个细节设计和调整的考虑，有助于最大限度地提高系统的吞吐量。我们还讨论了克尔介质内的信号和泵光束的空间和时间上的重叠，以及详细的协议光谱采集获得的协议。最后，我们报告了几个有代表性的拉曼光谱中存在强荧光，用我们的时间浇注系统取得的成果。
Protocol
1。在准备，并把这个系统内的拉曼样品，必须采取一定的照顾。
- 由于该系统通常使用非常高数值孔径物镜，工作距离很短，样品置于盖玻片上。生物样品通常是放置在1号安装盖玻片厚度Attofluor细胞室（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）。
- 液体样品，特别是那些对人体无毒，被放置在一个小玻璃瓶，巩固有机硅环氧开幕盖玻片。瓶子，然后倒测量。
- 因为我们的系统上取决于泵和脉冲信号的精确定时，我们不使用我们的显微镜的传统重点的调整，转换的目标，向上和向下的约束。这将增加和减去从我们的系统的光路。相反，我们我们的样本放在显微镜阶段，有其自身的独立的集中控制的顶部安装一个中学阶段。
2。为了利用时间选通的拉曼光谱，激发光必须得到妥善的准备。
- 我们开始与光从2.4 W可调脉冲钛新兴：Sapph激光（变色龙，相干系统，美国加州圣克拉拉市）。在80 MHz的脉冲序列的每个脉冲有30个新泽西州的能源，有140 FS的时间宽度，并在808纳米〜6 nm的光谱带宽与中心的频谱。
- 为了防止重新进入激光腔反射，光线通过一个法拉第隔离。法拉第隔离器前放置一个半波板允许进入系统发送的总功率连续调谐。
- 由于6纳米是一个过于宽泛的带宽，以解决最拉曼模式，光束通过一个很窄（0.8 nm的FWHM，安多弗公司，新罕布什尔州Salem）带通滤波器为808 nm为中心的发送。
- 消色差的双峰上一个5毫米的β-钡硼酸（BBO）晶体（CASIX，福州，福建，公关中国）从808纳米到404纳米的波长减半（F = 100毫米）的光，然后集中。 BBO晶体放置在尖端和倾斜控制山，也翻译舞台上安装。为了最大限度地提高波长转换的效率，必须放置水晶正是左右对称的双重焦点，其晶轴对齐传入的光束的偏振。
- 由于偏振相关波长转换效率，控制发送到样品的光量可放置法拉第隔离器后的第二个半波片。通过旋转此波片，发送到样品的光的强度可以调整独立泵束（下面要讨论的）发送的强度。
- 第二个消色差的双重选择退出束足够大，以补回的显微镜物镜光圈，和成一个倒置显微镜（IX - 71，奥林巴斯（F = 500 mm的），波长转换光recollimated中心谷，PA）通过两个转向镜子。
- 显微镜的物镜，被安置在系统的最单片元件的光学元件，定义光轴。为了激发光对准轴，一面镜子放置在显微镜的样本平面。两个转向镜子，然后反复调整，同时观察上的CCD摄像头时代（μEye，IDS，Obersulm，德国），连接到显微镜的成像端口的背反射的激光束。假设，在相机上的形象是在显微镜的领域 - 的的观点为中心，梁是上的轴时，焦斑是在显微镜芯片和客观的翻译沿z轴为中心不会更改中心点散焦光束。
- 当样品放置在样品平面照射激光光发生拉曼散射。放在显微镜下面的目标分色过滤器分离移波长激发光从拉曼散射光（荧光），指导拉曼散射光显微镜的侧面端口。显微镜进行了修改，以消除任何在这条道路的镜片，这样的信号光从平行显微镜出现。
- 由于信号光从显微镜中出现的是较明确的格兰 - 汤普森偏振片光圈较大，一个0.47x望远镜建造两个消色差双峰（F1 = 75毫米，F2 = 35毫米），是用来缩小光束。
- 光信号，然后由一个格兰 - 汤普森偏振片在0 °为导向，尊重在实验室内的垂直极化，并指示，在那里与泵束重组到分色镜。
3。为了光闸以最高效率运作，必须小心编制以及泵的梁（克尔梁）。
4。随着两束相结合，科尔门和收集系统设置为最大限度地收集的时间选通信号。
- 泵和信号光束先通过分色过滤器，在404纳米，外径6，防止任何令人兴奋的拉曼散射的残余激发光在非线性介质。
- 泵和信号光束，然后都集中到1厘米光程包含非线性材料的石英比色皿（F = 35毫米）消色差双峰。任何非线性材料，有一个适当的高非线性指数（高于CS 2），并适当短的时间响应（<2个PS），可以利用这里。对于这些实验中，我们使用二硫化碳，CS 2中 ，有一个非线性折射率n 2 = 3.1 × 10 -18米2 / W光recollimated焦距相同，第一个与第二双峰。
- 梁，然后通过和格兰 - 汤普森在一个旋转的贴装分析仪，然后通过吸收和干扰过滤器相结合，有一个808纳米的OD 10。
- 最后，信号光的重点是消色差的双峰（F = 35毫米到50μm多模光纤，其中光纤是安装在一个阶段，可在X，Y和Z的翻译）纤维，然后加上一个附加的CCD相机（SP2300i和PIXIS 100B，分别由普林斯顿仪器，特伦顿制造，新泽西州）的商业成像摄谱仪。
- 要对齐收集系统，以最大限度地采集到的信号，分析仪设置为0 °和测试样本的甲苯在样品平面上。通过调节X，Y，Ž控制的光纤安装，收集的拉曼信号进行了优化。
- 为了确保适当的空间和时间上的泵和信号光束的重叠，镜子被放置在显微镜的样本平面。 404纳米过滤器从系统中删除。随着分析仪旋转到90 ° retroreflected 404纳米束送入摄谱仪的调整等，它不饱和相机的强度。泵束的关闭，该分析仪是旋转，以尽量减少传输的404 nm的信号。泵束的重新开启，延迟阶段是慢慢调整，直至404纳米的光传输开始增加。然后，通过反复调整的延迟阶段，压电电镜，X，Y，和纤维的Z控制，最大限度地提高信号。
- 由于复古反映404纳米的光束和拉曼散射光，可采取略有不同的路径，通过该系统，最终的调整是由放置在样品阶段和轻微的调整对齐，通过改变很强的拉曼散射（如甲苯）延迟阶段，piezeo电镜，X，Y和Z和光纤控制，以优化的拉曼信号。
5。一个单一的时间选通拉曼光谱收集需要几个光谱采集到正确的系统工件。
- 随着设置为0 °，激发光束和关闭泵束的，“非门”频谱分析仪，代表没有时间浇注系统的好处，将收购的频谱。
- 随着分析仪设置为90 °，激发光泵束的仍然关闭，一回地面频谱，杂散光通过偏振片和系统中的其他要素的泄漏量。
- 分析仪，其余90 °和所有梁，采取“门控”频谱，允许通过交叉偏光片的拉曼散射光泵束的存在。
- 最后，仍然在90 °的分析仪，激发光泵束，第二个背景谱是，代表“门”进入光谱仪的光为808 nm的残留量的频谱作出贡献。
- 此外，频谱是采取关闭所有的激光器，特征基线“黑暗”的相机和电子信号水平。
- 由于光谱往往需要漫长的整合时间，这是必须分解成数块（帧）的积分时间，允许适当的矫正宇宙射线 - 超过几分钟的时间跨度获取数据时常见的问题。
6。收购完成后，几个处理步骤，有利于提高数据的质量和外观。
- 首先，所有的光谱都黑了纠正，减去“黑暗”的频谱。
- 为了正确的宇宙射线，构成一个采集的几帧是一个像素由像素的基础上相互比较。对于任何任何以外，所有帧的像素中值的2位数偏差的帧的像素，该像素的值是在所有帧中值取代。
- 宇宙射线纠正帧，然后平均通过Savitzky - Golay滤波平滑。
- 要提取的“真实”的选通频谱，我们减去“激发只”和“泵仅”从选通频谱测量的光谱。
- 最后，门和非门的光谱，再减去5阶多项式，确定使用Lieber和Mahadevan 扬森 2方法纠正的背景。
7。代表性的成果：
图1。克尔门控系统的示意图。泵束的路径显示为红色，而倍频路径以蓝色显示。拉曼光谱和荧光重叠的路径显示为绿色，而显示为黄色荧光时间已被过滤掉的路径。缩写如下：BPF，带通滤波器，CCD电荷耦合器件; DCM的分色镜; FI，法拉第隔离;λ/ 2，半波片;低通滤波器，长通滤波器; NLM时，非线性介质，P，偏振片二次谐波，二次谐波产生晶体。
图2顶：浸油溶解香豆素的原始光谱。红色曲线显示举行开放（最大传输分析仪）的门采取的频谱。黑色曲线显示对齐最小传输和泵束的应用（选通频谱）分析仪频谱。蓝色曲线显示与最小传输和无泵束的应用对齐分析仪采取的spectum（门举行闭门）。绿色曲线显示，只有泵束的应用而采取的频谱。虚线洋红色线显示面板图所示的光谱区域。所有的光谱已经与11点，三阶Savitzky - Golay滤波平滑。底部：香豆素的光谱，荧光背景减法油浸泡后溶解。红色曲线的频谱与门打开，和蓝色的曲线是选通频谱。选通频谱清楚地显示了令人费解的油的高波数峰值的特点。
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Discussion
拉曼光谱生物医学领域已经看到在过去的几年中，作为其表现出的潜力解决一些困难的挑战，在生物诊断的越来越大的兴趣。例如，拉曼光谱已经证明，在癌症的检测3，4，5，6诊断价值。拉曼光谱技术也已用于细菌定量7，8和细菌对药物的反应9。它也发现在其他医学领域的应用范围从骨骼健康10 biofluid分析，11，12的广泛应用。
然而，尽管有这样的潜力巨大，拉曼光谱有一个大障碍：在大多数生物系统来其极弱的横截面。因此，拉曼信号可以很容易地不堪重负，即使相当温和的荧光背景。存在许多技术去除荧光线型2，13，14。然而，这些技术都没有真正解决的主要问题具有很强的荧光背景的散粒噪声频谱的荧光背景淹没的拉曼信号的存在并不能减去。已经开发了一些技术，如相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）和受激拉曼散射（或逆拉曼散射），试图放大拉曼信号15，16，17的强度。然而，所有这些技术主要适用于透明样品，并有自己的背景和化学敏感性 18问题。
屏蔽的荧光信号的探测器，只有这样，才能真正拒绝自发拉曼散射的荧光背景的散粒噪声。早在十年前，Matousek等。表现出的荧光排斥使用超快克尔快门时间隔离拉曼和荧光信号，19， 20。然而，迄今为止，该系统还没有发现在生物领域，由于过高的脉冲能量的需要广泛使用。相反，在这个通信系统，采用的脉冲能量比以前的一些报告弱于1000倍，并与生物系统兼容。
我们的系统，如图1所示，采用了线的科尔门的几何形状，以节省电力，并提供尽可能多的范围内尽可能的非线性介质之间的泵和信号光束重叠。此外，我们照顾，以减少光损失，尽可能确保我们拥有的最大可用功率操作克尔快门使用这个系统我们已获得高度荧光生物样品，即茉莉花茎的拉曼光谱，没有任何光损伤21日的观察，。在这份报告中，我们将展示一些有代表性的数据上的一种植物为基础的荧光基团的模型系统（香豆素，τF≈5 NS）溶解在显微镜浸油。这是在图2所示。在顶部面板中，我们看到在红色的强烈的“非门”频谱（分析仪设置为0 °），调整到0.04％，其最大值为可视化的目的。请注意，有没有有迹可寻可见拉曼峰。下面，黑色，是原始的选通频谱（即泵和激励激光器的频谱）。下面，蓝色的，只是激发激光，通过交叉偏光片的残余荧光泄漏谱。最后，在绿色中，我们看到的背景，由于泵浦激光器，通过放置在系统中的吸收和干扰滤波器的组合泄漏。在图的下半部分2我们看到了一个次区域（地区在上游面板的虚线洋红色线表示）减去一个5阶多项式之后的非门和选通频谱。选通频谱清楚地表明了高波数峰值与血脂相关，而非门的频谱有没有明确的拉曼光谱特征。
虽然我们的制度不伟大effciency目前经营（maxiumum传输测量有5％左右），绝对信号强度通常小于信号对噪声的重要。有几个大生物样品中的类，用于测量常规拉曼光谱是很难或不切实际由于热烈的荧光背景。对于这些样本，我们的系统可以提供一个明确的信号噪音改善，图2清楚地看到。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国家科学基金会奖DBI的0852891。号PHY0120999根据合作协议，由加利福尼亚大学戴维斯分校生物光子科学与技术，一个指定的美国国家科学基金会科学技术中心管理中心还资助了这项工作的一部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lenses | Thorlabs Inc. | Various | All lenses coated to have maximum transmission losses of 1% each |
| Tunable Ti:Sapph laser | Coherent Inc. | Chameleon | 30 nJ, 200 fs, 80 MHz |
| 40X oil immersion objective | Olympus Corporation | UApo/340 | NA = 1.35 |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | IX-71 | Modified to remove all lenses in side port |
| Half wave plate | Thorlabs Inc. | AHWP05M-600 | |
| Glan-Thompson polarizer | Thorlabs Inc. | GTH10M | ∼10% transmission loss |
| Spectrometer | Princeton Instruments/Acton | SP2300i | |
| CCD | Princeton Instruments/Acton | Pixis 100B | |
| Mathmatical software | Mathworks | MATLAB | version 2008a |
| Faraday isolator | EOT | BB8-5I | |
| Piezo-electric mirror | Newport Corp. | AG-M100 | |
| BBO crystal | CASIX | custom | 1 mm thickness |
| Bandpass filter 1 | Andover | 008FC14 | 808 ± 0.4 nm |
| Dichroic mirror | Semrock | FF662-FDI01 | band edge at 662 nm |
| Long-pass filter | Semrock | BLP01-405R | band edge at 417 nm |
| Bandpass filter 2 | Semrock | FF02-447/60 | 417-447 nm |
| CS2 | Sigma-Aldrich | 335266 | 99% purity |
| Coumarin 30 | Sigma-Aldrich | 546127 | 99% purity |
| Immersion oil | Cargill Labs | 16242 | Type DF |
References
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