Dissection et l'imagerie de zones actives dans le Drosophile Jonction neuromusculaire
Summary
La jonction neuromusculaire (JNM) de<em> Drosophila melanogaster</em> Est un système modèle important pour étudier la fonction synaptique normale ainsi que des perturbations de la fonction synaptique dans certaines maladies neurologiques. Nous présentons un protocole de dissection de la<em> Drosophile</em> Larvaires système de moteur et immunocoloration des protéines zone active au sein du MNJ.
Abstract
La drosophile larves jonction neuromusculaire (JNM) est un excellent modèle pour l'étude de la structure synaptique et la fonction. Drosophile est bien connue pour la facilité de puissantes manipulations génétiques et le système nerveux des larves s'est révélée particulièrement utile pour étudier non seulement la fonction normale, mais aussi des perturbations qui accompagnent certaines maladies neurologiques (Lloyd et Taylor, 2010). Bon nombre des principaux molécules synaptiques trouvés chez la drosophile sont également présents chez les mammifères et comme la plupart des synapses excitatrices du système nerveux central chez les mammifères, la drosophile est JNM glutamatergique et démontre dépendant de l'activité de remodelage (Koh et al., 2000). En outre, les neurones de drosophile peuvent être identifiés individuellement, car leurs habitudes innervation sont stéréotypés et répétitifs permettant d'étude a identifié terminaisons synaptiques, telles que celles entre les motoneurones et les fibres musculaires du corps-mur qu'ils innervent (Keshishian et Kim, 2004). L'existence de composants synapse évolutivement conservés avec la facilité de la manipulation génétique et physique rendre le modèle idéal pour étudier la drosophile mécanismes sous-jacents de la fonction synaptique (Budnik, 1996).
Les zones actives à terminaisons synaptiques sont d'un intérêt particulier parce que ce sont les sites de la libération des neurotransmetteurs. NC82 est un anticorps monoclonal qui reconnaît la drosophile la protéine Bruchpilot (BRP), une membre de la famille CAST1/ERC qui est un élément important de la zone active (Wagh et al., 2006). BRP a montré d'adapter directement la zone active T-bar et est responsable de regroupement efficace canaux Ca 2 + sous la barre en T de densité (Fouquet et al., 2009). Mutants de BRP ont réduit de Ca 2 + densité de canaux, déprimé communiqué vésicules évoqués, et modifié à court terme de plasticité (Kittel et al., 2006). Modifications aux zones actives ont été observées dans les modèles de la maladie chez la drosophile. Par exemple, l'immunofluorescence utilisant l'anticorps NC82 a montré que la densité de la zone active a diminué dans les modèles de la sclérose latérale amyotrophique et Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. Ainsi, l'évaluation des zones actives, ou d'autres protéines synaptiques, dans les modèles de larves de drosophile de la maladie peut fournir un indice précieux initiale à la présence d'un défaut synaptique.
Préparer l'ensemble de montage des larves de drosophile disséquées pour l'analyse par immunofluorescence de l'JNM exige une certaine habileté, mais qui peut être accompli par la plupart des scientifiques avec un peu de pratique. Présenté est une méthode qui permet aux larves de plusieurs à être disséqués et immunocolorés dans le plat même dissection, limitant les différences environnementales entre chaque génotype et en fournissant suffisamment d'animaux pour la confiance dans la reproductibilité et l'analyse statistique.
Protocol
Discussion
Pour les neurones, la zone du terminal synaptique est d'une importance cruciale, et il est le pont pour une bonne communication entre les post-et pré-synaptique des cellules. Un moyen puissant pour étudier la santé des neurones dans des modèles de la maladie est d'analyser les protéines du terminal synaptique par immunofluorescence. La méthode d'immunofluorescence présenté ici permet au chercheur d'examiner de nombreuses larves simultanément tout en limitant les différences entre les groupes en…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Nael Alami et le Dr Nam Chul Kim pour leurs précieux commentaires sur ce manuscrit.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 68037-59-2 | After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more. |
| Stainless Steel Minutien PIns | Fine Science Tools | 26002-10 | Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors |
| Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins) | Fine Science tools | 11223-20 | Use as blunt forceps for grasping pins |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| SuperFine Vannas Scissors, 8cm long | World Precision Instruments | 501778 | |
| Mouse anti-Brp antibody | DSHB | NC82 | Use 1:50 dilution |
| Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-165-021 | Use at 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11001 | Use approx. 1:200 dilution |
Riferimenti
- Budnik, V. Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions. Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).
- Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).
- Hoang, B., Chiba, A. Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses. Biologia dello sviluppo. 229, 55-70 (2001).
- Keshishian, H., Kim, Y. -. S. Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system. Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).
- Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release. Science. 312, 1051-1054 (2006).
- Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity. Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).
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- Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism. PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).
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