Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse
Summary
Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) von<em> Drosophila melanogaster</em> Ist ein wichtiges Modellsystem für die Untersuchung normale synaptische Funktion sowie Störungen der synaptischen Funktion in bestimmten neurologischen Erkrankungen gefunden. Wir präsentieren ein Protokoll für die Präparation des<em> Drosophila</em> Larven motorischen System und Immunfärbung für aktive Zone Proteine innerhalb der NMJ.
Abstract
Die Drosophila-Larven neuromuskulären Synapse (NMJ) ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der synaptischen Struktur und Funktion. Drosophila ist bekannt für die Leichtigkeit des starken genetischen Manipulationen und die Larven des Nervensystems hat sich besonders bewährt bei der Untersuchung nicht nur die normale Funktion, sondern auch Störungen bekannt daß begleiten einige neurologische Erkrankung (Lloyd und Taylor, 2010). Viele wichtige synaptische Moleküle in Drosophila gefunden werden auch in Säugetieren gefunden und wie die meisten ZNS-Synapsen in Säugetieren ist das Drosophila NMJ glutamatergen und zeigt Aktivität abhängig Umbau (Koh et al., 2000). Darüber hinaus können Drosophila Neuronen werden individuell identifiziert, weil ihre Innervation Muster stereotype und repetitive machen es möglich, identifiziert synaptischen Terminals, wie sie zwischen Motoneuronen und der Körper-Wand Muskelfasern, die sie innervieren (Keshishian und Kim, 2004). Studie Die Existenz der evolutionär konserviert Synapse Komponenten zusammen mit der Leichtigkeit von genetischen und physikalische Manipulation machen die Drosophila-Modell ideal für die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen synaptischer Funktion (Budnik, 1996).
Die aktiven Zonen am synaptischen Terminals sind von besonderem Interesse, da diese die Standorte der Freisetzung von Neurotransmittern sind. NC82 ist ein monoklonaler Antikörper, der Drosophila-Protein Bruchpilot (BRP), ein CAST1/ERC Familienmitglied, das ein wichtiger Bestandteil der aktiven Zone (Wagh et al., 2006) wird anerkannt. Brp wurde gezeigt, direkten Einfluss auf die aktive Zone T-bar und ist verantwortlich für die effektive Bündelung Ca 2 +-Kanäle unter dem T-Bar-Dichte (Fouquet et al., 2009). Mutanten von BRP haben Ca 2 + reduziert Kanaldichte, deprimiert evozierte Vesikelfreisetzung und veränderte kurzfristige Plastizität (Kittel et al., 2006). Änderungen an aktiven Zonen in Drosophila Krankheitsmodelle beobachtet worden. Zum Beispiel zeigten Immunfluoreszenz mit dem NC82-Antikörper, der die aktive Zone Dichte in Modellen von amyotrophe Lateralsklerose und Pitt-Hopkins-Syndrom (Ratnaparkhi et al, 2008.; Zweier et al, 2009.) Verringert wurde. So kann die Evaluierung von aktiven Zonen oder anderen synaptischen Proteinen, in Drosophila-Larven Modelle von Krankheiten stellen eine wertvolle erste Hinweise auf die Anwesenheit eines synaptischen Defekt.
Vorbereiten ganzen Berg seziert Drosophila-Larven für Immunfluoreszenz Analyse der NMJ erfordert etwas Geschick, kann aber von den meisten Wissenschaftlern mit ein wenig Übung erreicht werden. Präsentiert wird eine Methode, die für mehrere Larven präpariert und immungefärbt in der gleichen Präparation Gericht stellt, Begrenzung der Umwelt-Unterschiede zwischen den einzelnen Genotyp und bietet genügend Tiere für das Vertrauen in die Reproduzierbarkeit und statistische Analyse.
Protocol
Discussion
Für Neuronen wird die synaptische Anschlussbereich von entscheidender Bedeutung, und ist die Brücke für eine ordnungsgemäße Kommunikation zwischen dem post-und pre-synaptischen Zellen. Ein guter Weg, um die Gesundheit des Neurons in Krankheitsmodelle zu untersuchen ist, Proteine der synaptischen Terminals durch Immunfluoreszenz analysiert. Die Immunfluoreszenz hier vorgestellte Methode ermöglicht es dem Forscher, viele Larven gleichzeitig zu untersuchen, während die Begrenzung der ökologischen Unterschiede…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Nael Alami und Dr. Nam Chul Kim für ihre hilfreichen Kommentare zu diesem Manuskript.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 68037-59-2 | After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more. |
| Stainless Steel Minutien PIns | Fine Science Tools | 26002-10 | Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors |
| Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins) | Fine Science tools | 11223-20 | Use as blunt forceps for grasping pins |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| SuperFine Vannas Scissors, 8cm long | World Precision Instruments | 501778 | |
| Mouse anti-Brp antibody | DSHB | NC82 | Use 1:50 dilution |
| Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-165-021 | Use at 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11001 | Use approx. 1:200 dilution |
Riferimenti
- Budnik, V. Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions. Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).
- Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).
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- Keshishian, H., Kim, Y. -. S. Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system. Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).
- Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release. Science. 312, 1051-1054 (2006).
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