La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular
Summary
La unión neuromuscular (UNM) de<em> Drosophila melanogaster</em> Es un importante sistema modelo para estudiar la función sináptica normal, así como las perturbaciones de la función sináptica en ciertas enfermedades neurológicas. Se presenta un protocolo para la disección de la<em> Drosophila</em> Larval del sistema motor y la inmunotinción de proteínas de la zona activa dentro de la UNM.
Abstract
La Drosophila larvas de la unión neuromuscular (UNM) es un excelente modelo para el estudio de la estructura y la función sináptica. Drosophila es bien conocido por la facilidad de manipulación genética de gran alcance y el sistema nervioso de larvas ha demostrado ser particularmente útil para estudiar no sólo la función normal, sino también las perturbaciones que acompañan a algunas enfermedades neurológicas (Lloyd y Taylor, 2010). Muchas moléculas clave sináptica en Drosophila también se encuentran en los mamíferos y como la mayoría de las sinapsis excitadoras del SNC en los mamíferos, la Drosophila NMJ es glutamatérgica y demuestra dependiente de la actividad de remodelación (Koh et al., 2000). Además, las neuronas de Drosophila pueden ser identificados individualmente, porque sus patrones de inervación son estereotipados y repetitivos que permiten al estudio identificó las terminales sinápticas, como las que existen entre las neuronas motoras y las fibras musculares de la pared del cuerpo que inervan (Keshishian y Kim, 2004). La existencia de los componentes de la sinapsis conservado evolutivamente, junto con la facilidad de manipulación genética y física que el modelo de Drosophila ideal para investigar los mecanismos subyacentes a la función sináptica (Budnik, 1996).
Las zonas activas en las terminales sinápticas son de particular interés debido a que estos son los sitios de liberación de neurotransmisores. NC82 es un anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína de Drosophila Bruchpilot (BRP), un miembro de la familia CAST1/ERC que es un componente importante de la zona activa (Wagh et al., 2006). BRP ha demostrado que la forma directa de la zona activa T-bar y es responsable de manera efectiva la agrupación Ca 2 + canales por debajo de la densidad de T-bar (Fouquet et al., 2009). Los mutantes de BRP han reducido la densidad de Ca 2 + canal, deprimido liberación evocada vesícula, y la alteración a corto plazo plasticidad (Kittel et al., 2006). Alteraciones en las zonas activas se han observado en modelos de enfermedad de Drosophila. Por ejemplo, la inmunofluorescencia con el anticuerpo NC82 mostraron que la densidad de la zona activa se redujo en los modelos de la esclerosis lateral amiotrófica y el síndrome de Pitt-Hopkins (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. Por lo tanto, la evaluación de las zonas activas, o de otras proteínas sinápticas, en los modelos de las larvas de Drosophila de la enfermedad pueden proporcionar una valiosa pista inicial a la presencia de un defecto sináptica.
La preparación de todo el montaje disecados larvas de Drosophila para el análisis de inmunofluorescencia de la UNM requiere cierta habilidad, pero se puede lograr por la mayoría de los científicos con un poco de práctica. Que se presenta es un método que ofrece para las larvas de varios de ser diseccionado y immunostained en el plato de la disección mismo, lo que limita las diferencias ambientales entre cada genotipo y proveer suficientes animales para la confianza en la reproducibilidad y el análisis estadístico.
Protocol
Discussion
Para las neuronas, la zona de la terminal sináptica es de vital importancia, y es el puente para la correcta comunicación entre el puesto y las células pre-sináptica. Una forma poderosa para investigar la salud de las neuronas en modelos de enfermedad es analizar las proteínas de la terminal sináptica por inmunofluorescencia. El método de inmunofluorescencia que aquí se presenta permite al investigador para examinar las larvas de manera simultánea al tiempo que limita las diferencias ambientales entre los grupo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Nael Alami y el Dr. Nam Chul Kim por sus útiles comentarios sobre este manuscrito.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 68037-59-2 | After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more. |
| Stainless Steel Minutien PIns | Fine Science Tools | 26002-10 | Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors |
| Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins) | Fine Science tools | 11223-20 | Use as blunt forceps for grasping pins |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| SuperFine Vannas Scissors, 8cm long | World Precision Instruments | 501778 | |
| Mouse anti-Brp antibody | DSHB | NC82 | Use 1:50 dilution |
| Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-165-021 | Use at 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11001 | Use approx. 1:200 dilution |
Riferimenti
- Budnik, V. Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions. Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).
- Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).
- Hoang, B., Chiba, A. Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses. Biologia dello sviluppo. 229, 55-70 (2001).
- Keshishian, H., Kim, Y. -. S. Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system. Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).
- Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release. Science. 312, 1051-1054 (2006).
- Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity. Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).
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- Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., Dürrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila. Neuron. 49, 833-844 (2006).
- Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila. Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).
