生殖障害を持つヒトで同定されたGC -リッチなKISS1受容体配列の遺伝的変異の変異導入と解析
Summary
キスペプチン受容体（KISS1R）の変異は患者の生殖障害に関連付けられています。ここでは、免疫沈降とウェスタンブロットによる受容体の分解経路を特徴づけるためにKISS1RのGC -リッチ配列と同様にKISS1Rの構文の使用に関心の突然変異を導入する方法について説明します。
Abstract
キスペプチン受容体（KISS1R）は思春期の引き金と成人1,2,3の生殖能力の調節因子として認識され、Gタンパク質共役型受容体です。患者で同定KISS1Rの不活性化変異がiodiopathic低ゴナドトロピン性性腺機能低下症（IHH）1,2と思春期早発症4に関連している。これらの変異体の機能的研究は、この受容体による生殖の調節だけでなく、病気の結果を整形したものと、結果は異常KISS1Rシグナリングと機能からの根底にあるメカニズムの理解にとってきわめて重要である。しかし、KISS1Rの遺伝子の高度にGC -リッチ配列は、それはかなり困難な突然変異を導入またはPCRによってこの受容体をコードする遺伝子を増幅することができます。
ここでは、我々の研究室で十数KISS1R変異体を介して生成するために正常に使用されているこの非常にGCリッチな配列に興味の変異を導入する方法を説明します。我々はKISS1Rシーケンスで置換、欠失又は挿入を含むKISS1R変異体の範囲の増幅を促進するためのPCR条件を最適化してきました。 PCRエンハンサー溶液の添加は、同様にDMSOのわずかな割合のような増幅を向上させるために特に有用であった。この最適化された手順は、他のGCリッチなテンプレートの役に立つかもしれません。
KISS1Rをコードする発現ベクターは、変異がKISS1R機能を変更すると関連する生殖表現型に導く方法を理解するために、この受容体のシグナル伝達と機能を特徴付けるために使用されています。従って、部位特異的突然変異誘発により生成されたKISS1R変異体の潜在的なアプリケーションは、多くの研究1,4,5,6,7,8によって説明することができます。例として、思春期早発症に関連付けられているKISS1R（Arg386Pro）、、の機能獲得型変異はKISS1R 9の分解速度を変化させるリガンド刺激4と同様に受容体の応答性を延長することが示されている。興味深いことに、我々の研究は、ほとんどのGタンパク質共役受容体9のために説明古典リソソーム分解するのではなく、KISS1Rはプロテアソームにより分解されることを示している。ここで紹介する例では、KISS1Rの劣化は、一時的にmycタグKISS1R（MycKISS1R）を発現するヒト胎児腎臓細胞（HEK – 293）で検討されており、プロテアソームやリソソーム阻害剤で処理した。細胞溶解物をウェスタンブロット分析に続いてアガロース結合抗- myc抗体を用いて免疫沈降している。ブロット上MycKISS1Rの検出および定量は、LI – CORのオデッセイ赤外線システムを使用して実行されます。このアプローチでは、同様に関心のある他のタンパク質の分解の研究に有用である。
Protocol
Discussion
部位特異的突然変異誘発法は、30年以上を対象とした遺伝子のコーディング配列でヌクレオチド変化を導入することによって、蛋白質機能を研究するために使用されています。オリジナルの技術は、英国、カナダの化学者、ノーベル賞受賞者のマイケルスミス10で1978年に記述されていた。マイケルスミスはケイリーンマリス、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）11を発明したアメリ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
とチャールズHフード財団若手研究者母子保健研究賞（ボストン、マサチューセッツ州）によって – この作品の一部は国立小児保健発育研究所（R21 HD059015 NICHD）の生殖支店によって資金を供給された。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene | 600385 |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene | 200314 |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 |
| MG132 | Calbiochem | 47491 |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24948 |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | Millipore | 16-219 |
| 2x loading buffer | BioRad | 161-0737 |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | BioRad | 345-0028 |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Millipore | IPFL00010 |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
| 10xTBS | BioRad | 170-6435 |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell signaling | 2272 |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 78430 |
Riferimenti
- Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty. N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).
- de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).
- Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).
- Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty. N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).
- Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54. J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).
- Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).
- Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function. J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).
- Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner. PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).
- Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation. Endocrinology. , (2011).
- Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence. J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Sci Am. 262, 56-61 (1990).
- Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).
- Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions. Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).
- Kong, K. C., Poyner, D. R., Wheatly, M. Chapter 10. MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods. , 197-204 (2010).
- Hall, R. A., George, S. R., O’Dowd, B. F. Chapter 9. G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions. , 170-171 (2005).
- Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors. J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).
- Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin. Science. 294, 1307-1313 (2001).
