Mutagênese e análise de mutações genéticas nos receptores de Seqüência GC-rica KISS1 identificados em humanos com distúrbios reprodutivos
Summary
Mutações no receptor kisspeptina (KISS1R) estão associados com distúrbios reprodutivos em pacientes. Aqui nós descrevemos como introduzir mutações de interesse na seqüência GC-rica de KISS1R, bem como o uso de construções KISS1R para caracterizar a via de degradação do receptor por imunoprecipitação e western blot
Abstract
O receptor kisspeptina (KISS1R) é um receptor acoplado à proteína G reconhecido como o gatilho da puberdade e um regulador de competência reprodutiva na vida adulta 1,2,3. Mutações inativadoras no KISS1R identificados em pacientes têm sido associados com hipogonadismo hipogonadotrófico iodiopathic 1,2 (IHH) e puberdade precoce 4. Estudos funcionais destes mutantes são cruciais para nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à regulação da reprodução por este receptor, bem como aqueles moldar a evolução das doenças, que resultam de sinalização KISS1R anormal e função. No entanto, a seqüência altamente GC-rica do gene KISS1R torna bastante difícil a introdução de mutações ou amplificar o gene que codifica este receptor pela PCR.
Aqui nós descrevemos um método para introduzir mutações de interesse para esta seqüência altamente GC-rica que tem sido utilizado com sucesso para gerar mais de uma dúzia de mutantes KISS1R em nosso laboratório. Nós otimizamos as condições de PCR para facilitar a ampliação de uma série de mutantes KISS1R que incluem substituições, supressões ou inserções na seqüência KISS1R. A adição de uma solução enhancer PCR, bem como de uma pequena porcentagem de DMSO foram especialmente úteis para melhorar a amplificação. Este procedimento otimizado pode ser útil para outras GC-rica modelos também.
O vetor de expressão que codifica a KISS1R está sendo usado para caracterizar a sinalização e função desse receptor, a fim de entender como as mutações podem mudar KISS1R função e levar a fenótipos associados reprodutiva. Assim, as aplicações potenciais de mutantes KISS1R gerados por mutagênese sítio-dirigida pode ser ilustrado por muitos estudos 1,4,5,6,7,8. Como exemplo, a mutação de ganho de função-nos KISS1R (Arg386Pro), que está associada com puberdade precoce, foi mostrado para prolongar a capacidade de resposta do receptor à estimulação ligante 4, bem como de alterar a taxa de degradação da KISS1R 9 . Curiosamente, nossos estudos indicam que KISS1R é degradada pelo proteassoma, em oposição à degradação lisossomal clássico descrito para a maioria das proteínas G-coupled receptors 9. No exemplo aqui apresentado, a degradação do KISS1R é investigada em células embrionárias do rim (HEK-293) transitoriamente expressando-Myc tag KISS1R (MycKISS1R) e tratados com inibidores de proteassoma ou lisossomos. Lisados celulares são immunoprecipitated agarose usando um conjugado anticorpo anti-myc seguido de western blot. Detecção e quantificação de MycKISS1R em blots é realizada utilizando o Sistema Odyssey LI-COR Infrared. Esta abordagem pode ser útil no estudo da degradação de outras proteínas de interesse também.
Protocol
Discussion
Sítio-dirigida mutagênese tem sido utilizado para estudar a função de proteínas através da introdução de mudanças de nucleotídeos na seqüência de codificação de genes alvo por mais de três décadas. A técnica original foi descrita em 1978 pelo químico britânico-canadense e Prêmio Nobel Michael Smith 10. Michael Smith dividiram o Prêmio Nobel de 1993 em Química com Kary Mullis, o bioquímico americano que inventou o Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 11. O método original d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Poder Reprodutiva do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (NICHD – R21 HD059015) e pela capa Charles H. Young Foundation Investigator Award Criança Pesquisa em Saúde (Boston, MA).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| 10x PCRx Enhancer Solution | Invitrogen | 52391 |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase Alternative Detergent | Stratagene | 600385 |
| Dpn-I | New England Biolabs | R0176 |
| XL10-Gold Ultracompetent E. coli cells | Stratagene | 200314 |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Geneporter Transfection Reagent | Genlantis | T201007 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 |
| MG132 | Calbiochem | 47491 |
| 10xPBS | Ambion | AM9625 |
| Protease inhibitor cocktail and PMSF | Santa Cruz Biotechnology | Sc-24948 |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
| anti-Myc tag (clone 4A6) agarose conjugate | Millipore | 16-219 |
| 2x loading buffer | BioRad | 161-0737 |
| Criterion Tris-HCl precast gel, 4-15% gradient | BioRad | 345-0028 |
| Immobilon-FL PVDF membrane | Millipore | IPFL00010 |
| Odyssey Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
| 10xTBS | BioRad | 170-6435 |
| Rabbit anti-myc antibody | Cell signaling | 2272 |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| Odyssey Imaging Infrared System | LI-COR Biosciences | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 78430 |
Riferimenti
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