आरएनएआई स्क्रीनिंग में Postembryonic phenotypes पहचानें सी. एलिगेंस</em
Summary
हम अवगत में प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण के postembryonic नियामकों की पहचान विधि का वर्णन<em> सी. एलिगेंस</em> एक जीनोमिक आरएनएआई आधारित स्क्रीन और एक एकीकृत transgene कि एक कार्यात्मक, प्रोटीन fluorescently टैग व्यक्त का उपयोग.
Abstract
सी एलिगेंस और कई जीनों और जीन एक रास्ते की खोज और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली साबित हो गया है. अधिक परिष्कृत उपकरण और इस प्रणाली में अध्ययन के लिए संसाधनों का अधिक सूक्ष्म phenotypes या भूमिकाओं के साथ जीन की निरंतर खोज की सुविधा कर रहे हैं.
यहाँ हम हम सी. पहचान के लिए अनुकूलित एक सामान्यीकृत प्रोटोकॉल के वर्तमान 2 आरएनएआई का उपयोग ब्याज की postembryonic phenotypes साथ एलिगेंस जीन. इस प्रक्रिया को आसानी से पसंद की परख फेनोटाइप विदारक या यौगिक सूक्ष्मदर्शी पर प्रकाश या प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी द्वारा, चाहे संशोधित किया गया है. इस स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के जीव के भौतिक संपत्ति और आणविक सी. उपकरण पर capitalizes एलिगेंस अनुसंधान समुदाय का उत्पादन किया गया है. एक उदाहरण के रूप में, हम एक एकीकृत transgene है कि एक आरएनएआई स्क्रीन में एक फ्लोरोसेंट उत्पाद व्यक्त के उपयोग के प्रदर्शन के लिए इस के सामान्य स्थानीयकरण के लिए आवश्यक जीन की पहचानदेर चरण लार्वा और वयस्कों में उत्पाद. सबसे पहले, हम पूरी लंबाई सीडीएनए आवेषण के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीनोमिक आरएनएआई पुस्तकालय का इस्तेमाल किया. इस पुस्तकालय उम्मीदवार जीन उत्पाद की आरएनएआई कमी से कई उम्मीदवारों की तेजी से पहचान की सुविधा है. दूसरा, हम एक एकीकृत transgene है कि एक आरएनएआई संवेदनशील पृष्ठभूमि में हमारे हित के fluorecently टैग प्रोटीन व्यक्त उत्पन्न. तीसरा, आरएनएआई रची जानवरों को उजागर करने के द्वारा, इस स्क्रीन उत्पादों है कि एक महत्वपूर्ण भ्रूण भूमिका है कि अन्यथा ब्याज की प्रोटीन को विनियमित करने में एक भूमिका के बाद भ्रूण मुखौटा होता है जीन की पहचान करने की अनुमति देता है. अन्त में, इस स्क्रीन एक यौगिक एकल कक्ष संकल्प के लिए सुसज्जित खुर्दबीन का उपयोग करता है.
Protocol
Discussion
आरएनएआई स्क्रीनिंग विधि यहाँ प्रस्तुत जीन एक सामान्य (या ट्रांसजेनिक) के postembryonic phenotype के लिए आवश्यक उत्पादों की एक संवेदनशील और तेजी से विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. उदाहरण दिखाया एक प्रोटीन fluorescently टैग क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों DBL 1 सीडीएनए और एक इंजेक्शन मार्कर के लिए डॉ. क्रिस्टोफर Rongo (Waksman संस्थान, Rutgers विश्वविद्यालय, न्यू जर्सी) के उपहार के लिए डा. रिक Padgett (Waksman संस्थान, Rutgers विश्वविद्यालय, न्यू जर्सी) को धन्यवाद देना चाहूंगा. डा. बार्थ अनुदान प्रयोगशाला GFP टैग DBL-1 का निर्माण कम प्रतिलिपि संख्या एकीकरण के लिए जीन बंदूक बमबारी प्रदर्शन किया. रेने गार्सिया प्रयोगशाला texIs100 के निर्माण के दौरान तकनीकी सहायता प्रदान की है. रेने गार्सिया, Robyn Lints के के, Hongmin और किन प्रयोगशालाओं उत्पादक सलाह प्रदान की है. यह काम शुरू हुआ धन द्वारा TAMHSC सेलुलर और आण्विक चिकित्सा विभाग से वित्त पोषित किया गया था. परिसर गुंजाइश और कताई डिस्क confocal विभाग और चिकित्सा डीन के कार्यालय की TAMHSC कॉलेज द्वारा प्रदान की गई धनराशि के साथ खरीदे थे.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |
Riferimenti
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetica. 157, 1217-1226 (2001).
- Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
- Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genetica. , (2011).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
- Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genetica. , 129-195 (1991).
- Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
- Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sarin, S., Prabhu, S., O’Meara, M. M., Pe’er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77, 71-94 (1974).
