RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em
Summary
Мы описываем чувствительный метод для выявления постэмбрионального регуляторов экспрессии белка и локализации<em> С. Элеганс</em> С помощью РНК-интерференции на основе геномных экран и встроенный трансгена, что выражает функциональный, помеченный флуоресцентной белка.
Abstract
C. Элеганс оказалась ценной моделью системы для обнаружения и функциональные характеристики многих генов и генных пути 1. Более сложные инструменты и ресурсы для проведения исследований в этой системе, способствуют дальнейшей открытие генов с более тонким фенотип или ролей.
Здесь мы приводим обобщенный протокол мы адаптировали для выявления C. Элеганс генов постэмбрионального фенотипы интерес использование RNAi 2. Эта процедура легко модифицируется для анализа фенотипа выбор, будь то свет или флуоресценции оптики на вскрытии или составной микроскоп. Этот протокол обследования капитализирует на физические активы организма и молекулярные инструменты C. Элеганс научное сообщество произвел. В качестве примера мы демонстрируем использование интегрированных трансгена, что выражает флуоресцентного продукта в экран RNAi, чтобы идентифицировать гены, необходимые для нормальной локализации этогоПродукт в конце стадии личинки и взрослые. Во-первых, мы использовали коммерчески доступный геномный RNAi библиотека с полной кДНК вставки. Эта библиотека обеспечивает быструю идентификацию нескольких кандидатов RNAi снижение продукт гена кандидата. Во-вторых, мы получили интегрированную трансгена, что выражает наше fluorecently меченый белок в РНК-интерференции с учетом фона. В-третьих, подвергая вылупившихся животных РНК-интерференции, этот экран позволяет идентифицировать генные продукты, которые играют жизненно важную роль эмбриональные, которые могли бы скрыть постэмбрионального роль в регуляции белков, представляющих интерес. Наконец, этот экран используется сложный микроскоп оборудован для одной резолюции клетки.
Protocol
Discussion
Метод РНК-интерференции скрининга представленные здесь позволяет чувствительный и быстрый анализ генных продуктов, необходимых для нормальной (или трансгенных) постэмбрионального фенотипа. Пример приведен экран для генов, вовлеченных в субклеточные локализации флуоресцентной мече…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Рик Паджетт (Ваксман институт, Rutgers University, Нью-Джерси) за дар DBL-1 кДНК и д-р Кристофер ронго (Ваксман институт, Rutgers University, Нью-Джерси) для инъекций маркера. Лаборатории доктора Барта Гранта осуществляется бомбардировка генной пушки низкой интеграции номер копии GFP с метками DBL-1 конструкции. Рене Гарсиа лаборатория оказала техническую помощь в процессе создания texIs100. Рене Гарсиа, Робин Lints и Hongmin Цинь лабораторий, продуктивный совет. Эта работа финансировалась запуска средства TAMHSC Отдел молекулярной и клеточной медицины. Область соединения и вращается диск конфокальной было приобретено на средства, предоставленные отделом и TAMHSC Медицинского колледжа Деканат.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |
Riferimenti
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetica. 157, 1217-1226 (2001).
- Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
- Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genetica. , (2011).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
- Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genetica. , 129-195 (1991).
- Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
- Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sarin, S., Prabhu, S., O’Meara, M. M., Pe’er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77, 71-94 (1974).
