[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em
Summary
نحن وصفا لطريقة توعية لتعريف المنظمين تال للمرحلة الجنينية من بروتين تعبير والتوطين في<em> C. ايليجانس</em> باستخدام شاشة الجينومية رني المستندة إلى والتحوير المتكاملة التي تعبر عن وظيفية، والبروتين الموسومة fluorescently.
Abstract
وقد ثبت جيم ايليجانس أن يكون نظام نموذجا قيما للاكتشاف وتوصيف وظيفي للجينات كثيرة ومسارات الجينات 1. أدوات أكثر تطورا وموارد لإجراء دراسات في هذا النظام وتسهيل اكتشاف الجينات مع استمرار الظواهر أكثر دهاء أو الأدوار.
هنا نقدم لبروتوكول المعمم نحن تكييفها لتحديد C. ايليجانس الجينات مع الظواهر تال للمرحلة الجنينية من الاهتمام باستخدام رني 2. يتم تعديل بسهولة هذا الإجراء لفحص النمط الظاهري في الاختيار، سواء من قبل بصريات ضوء أو مضان على مجهر تشريح أو مركب. هذا البروتوكول فحص تستفيد من الأصول المادية للكائن الحي والأدوات الجزيئية وجيم وقد أنتجت الأبحاث ايليجانس المجتمع. كمثال على ذلك، ونحن لشرح استخدام من التحوير المتكاملة التي تعبر عن منتج فلوري في شاشة رني لتحديد الجينات اللازمة لتوطين طبيعية من هذامنتج في مرحلة متأخرة اليرقات والكبار. أولا، استخدمنا المتاحة تجاريا مكتبة رني الجينومية مع كامل طول إدراج [كدنا]. هذه المكتبة يسهل التعرف السريع على تعدد المرشحين من قبل تخفيض رني المرشح منتج الجين. الثانية، ولدت لدينا خبير التحوير المتكاملة التي تعبر عن البروتين لدينا الموسومة fluorecently من اهتمام في خلفية رني حساسة. الثالثة، من خلال تعريض الحيوانات التي تحاك لرني، هذه الشاشة يسمح تحديد المنتجات الجينات التي لها دور حيوي الجنينية التي من شأنها أن تخفي ذلك دورا في مرحلة ما بعد الجنينية في تنظيم بروتين من الفائدة. أخيرا، هذه الشاشة يستخدم مجهر مركب مجهزة لقرار خلية واحدة.
Protocol
Discussion
طريقة فحص رني المقدمة هنا يمكن تحليل حساسة وسريعة من المنتجات الجينات المطلوبة لالنمط الظاهري (أو المعدلة وراثيا) طبيعي تال للمرحلة الجنينية. المثال المعروض هو الشاشة عن الجينات المسؤولة عن توطين التحت خلوية من البروتين الموسومة fluorescently. ومع ذلك، يمكن تعديل هذا البر…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور ريك بادجيت (اكسمان معهد، جامعة روتجرز بولاية نيو جيرسي) لهدية من [كدنا] DBL-1، والدكتور كريستوفر Rongo (اكسمان معهد، جامعة روتجرز بولاية نيو جيرسي) للحصول على علامة حقن. يقوم مختبر الدكتور بارث غرانت قصف مدفع الجينات لانخفاض نسخة دمج عدد من التركيبة GFP الموسومة-1 DBL. قدمت رينيه غارسيا مختبر المساعدة التقنية أثناء إنشاء texIs100. قدمت رينيه غارسيا، Lints روبين، وHongmin المختبرات تشين نصيحة الإنتاجية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل بدء أموال من وزارة TAMHSC الطب الجزيئي والخلوي. تم شراؤها في نطاق المجمع والغزل مبائر القرص مع الأموال التي تقدمها الإدارة، وكلية الطب TAMHSC من مكتب عميد.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
26 | |
| Agar-Agar | EMD Chemicals Inc. | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson – Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | Becton Dickinson – Difco CP | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any brand | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Brand | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma | 31742 | 100 μM – 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any brand | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any brand | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 |
Use tubing and settings appropriate for the machine |
Riferimenti
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetica. 157, 1217-1226 (2001).
- Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
- Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genetica. , (2011).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
- Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genetica. , 129-195 (1991).
- Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
- Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sarin, S., Prabhu, S., O’Meara, M. M., Pe’er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77, 71-94 (1974).
