Summary
الإجراء يدل على منهجية elastography بالرنين المغناطيسي لرصد نتائج هندسيا من الأنسجة الدهنية والبنى المكونة للعظم هندسيا من خلال تقييم محلي موسع من الخواص الميكانيكية باستخدام المجهرية elastography بالرنين المغناطيسي (μMRE).
Abstract
الاختبارات الميكانيكية التقليدية غالبا ما يؤدي إلى تدمير العينة، وذلك في حالة من الأنسجة على المدى الطويل بناء هندسيا دراسات، واستخدام تقييم مدمر غير مقبول. والبديل المقترح هو استخدام عملية التصوير المغناطيسي ودعا elastography الرنين. Elastography هو أسلوب غير تدميري لتحديد النتيجة هندسيا من خلال قياس قيمة العقارات المحلية الميكانيكية (أي مجمع معامل القص)، والتي هي علامات أساسية لتحديد هيكل وظيفة الأنسجة. كوسيلة لتقييم موسع، وشهدت رصد البنى هندسيا مع طرائق التصوير مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) اهتماما متزايدا في السنوات العشر الماضية 1. على سبيل المثال، كانت بالرنين المغناطيسي (السيد) تقنيات النشر وrelaxometry قادرة على توصيف تغيرات في الخواص الكيميائية والفيزيائية خلال تنمية الأنسجة المهندسة 2. الطريقة المقترحة فيالبروتوكول التالي يستخدم المجهرية elastography بالرنين المغناطيسي (μMRE) كأسلوب MR موسع مقرها لقياس الخواص الميكانيكية للأنسجة لينة صغيرة 3. ويتم تحقيق التوعية من مخاطر الألغام وذلك بربط 1 المحرك الصوتية الميكانيكية مع النسيج من اهتمام وتسجيل الموجات القص مع ماسح MR 4. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطبيق μMRE في هندسة الأنسجة للحصول على المعلومات الأساسية النمو الذي يقاس عادة باستخدام تقنيات العيانية المدمرة ميكانيكي 5. في الإجراء التالي، ويتحقق من خلال elastography التصوير من التركيبات الهندسية مع تسلسل تعديل تدور صدى هان إلى جانب وجود صمام ميكانيكي. كما هو مبين في الشكل 1، وتسلسل تعديل بالتزامن مع الحصول على الصور من انتقال موجات القص الخارجية؛ في وقت لاحق، والاقتراح هو توعية من خلال استخدام أزواج تتأرجح بين القطبين. بعد مجموعة من الصور مع sensitiza الحركة الإيجابية والسلبيةنشوئها، وتقسيم معقد للبيانات إنتاج صورة موجة القص. ثم، يتم تقييم الصورة باستخدام خوارزمية انعكاس لتوليد خريطة صلابة القص 6. وقد تبين القياسات الناتجة في كل فوكسل لربط بقوة (R 2> 0.9914) مع البيانات التي تم جمعها باستخدام التحليل الميكانيكي الحيوي 7. في هذه الدراسة، تم دمج elastography في الأنسجة عملية التنمية البشرية لرصد الخلايا الجذعية الوسيطة (ح MSC) التمايز في البنى المكونة للعظم مكون الشحم وكما هو مبين في الشكل 2.
Protocol
1. الأنسجة كونستركت التحضير
النسيج بناء عملية إعداد يتكون من ثلاث مراحل رئيسية هي: التوسع في عدد السكان الخلية، والبذر من الخلايا على سقالة بيولوجية، والتمايز من خلال استخدام جزيئات إشارات كيميائية. ويستند هذا الإجراء لإعداد التصور على أساليب التي أجرتها دنيس وآخرون، هونج وآخرون، وماريون وماو 8،9،10.
- بعد ثقافة وتوسيع خط الخلية، بذرة الإنسان الخلايا الجذعية الوسيطة (ح MSCS) على اسفنجة الجيلاتين (4 القطر مم، سماكة 3.5 ملم) في مناطق ذات كثافة من 1x10 6 خلية / مل للعظم وخلايا 3x10 6 / مل تشكيل الدهنية.
- إلى التمييز بين اللجان الدائمة ح إلى الدهنية، وتطبيق وسائل الإعلام الاستقراء الدهنية التي تتكون من ديكساميثازون ميكرومتر 1، 0،5 ميكرومتر الاستيوفينون-بالميثيل، 10 ميكروغرام / مل الإنسان المترابطة الانسولين، و 200 ميكرومتر في المتوسط اندوميثاسين توسيع الخليةمرة واحدة تظهر الخلايا متجمعة على منصة الاعدام. بعد ثلاثة أيام، ويحل محل وسائل الاعلام مع 10 ميكروغرام / مل من الانسولين البشري المؤتلف في وسائل الاعلام توسع لمدة 24 ساعة ثم العودة الى وسائل الاعلام الاستقراء. تكرار دورة ثلاث مرات، وتبادل وبعد ذلك فقط في وسائل الاعلام صيانة كل يومين.
- للحث على التعظم، وإعداد وسائل الاعلام الاستقراء المكونة للعظم من خلال جعل تركيز النهائي من ديكساميثازون 0.1 ميكرومتر، و 50 ميكرومتر من L-الاسكوربيك 2phosphate الحمضية، و 10 مللى β-جليسروفوسفات في المتوسط توسيع الخلية. استبدال مع وسائل الاعلام عظمية جديدة كل يومين.
2. المحرك توصيف
توصيف المحرك هو خطوة حيوية للتجربة التوعية من مخاطر الألغام. التوعية من مخاطر الألغام تعتمد على انتشار الموجات القص الميكانيكية لتقييم القيم المحلية من الخواص الميكانيكية، وبالتالي، فإن هذه الاهتزازات الميكانيكية يجب أن يتم إنشاؤها، وتميزت في الأنسجة من الاهتمام باستخدام المحرك كهرضغطية. ويتضح إكساءويرد mple من عملية التوصيف في الشكل 3. الهدف من هذا الإجراء هو لتحسين الحركة من المحرك من أجل توليد موجات القص غير ضارة مع سعة كبيرة (~ 250 ميكرون).
- قبل هذه التجربة، وتطبيق 0.5٪ الاغاروز هلام أن أرفق التصور في أنبوب اختبار 10 ملم. وينبغي أن درجة حرارة هلام تكون حوالي 37 درجة مئوية للحد من الأضرار التي لحقت بناء.
- بعد السماح للهلام الاغاروز خمس دقائق لتعيين في درجة حرارة الغرفة، إدراج غيض من السيارات والانحناء كهرضغطية إلى السطح من هلام.
- نعلق أنبوب يحتوي على عينة وصمام لدعم جامدة، وتوجيه شعاع من الليزر Vibrometer دوبلر نحو غيض من صمام ميكانيكي. ضبط وضع نظام لتحسين إشارة تعكس، استخدم تعكس الشريط إذا لزم الأمر.
- استنادا إلى تردد صدى المتوقعة من المحرك الميكانيكية، ووضع المولد وظيفة تغزو دesired النطاق الترددي (أي 20 حتي 2000 هرتز في هذه التجربة) باستخدام التيار الكهربائي التي تعمل من 20 VPP مع إشارة ضوضاء بيضاء.
- عرض الطيف يتميز على البرنامج Vibrosoft بوليتيك لتحديد تردد صدى للنظام ووضع برنامج لFFT والسرعة كما المحور ص.
- لقياس التشرد، وضبط المحرك لتقديم جيباني؛ شبه جيبي المستمر في وتيرة صدى المشار إليها باستخدام الجهد التشغيل من 200 VPP، ثم لاحظ التشريد ولدت يجري تسليمها إلى سطح هلام. ضبط Vibrosoft لعرض الاتحاد الفرنسي للتنس مع التشرد والمحور ص.
3. صورة اكتساب
- بعد الانتهاء من توصيف المحرك، ضع عينة والمحرك في وسط الماسح الضوئي التصوير بالرنين المغناطيسي. للتجارب التصور الأنسجة، واستخدام الترددات اللاسلكية لفائف صغيرة وأكثر حساسية (أي 10 ملم في هذه التجربة) لإرسال واستقبال الإشارات اللاسلكية. (الإجراء هو موضح يستخدم تي 9.4مغناطيس تتحمل عمودي مجهزة التدرجات المحور الثلاثي، 100 جم / سم).
- الحصول على صورة الكشفية لتحديد موقع بناء.
- تعيين المعلمات لاقتناء. وهناك عادة في المختبر سهمي الفحص وقتا تكرار MS 1000، وقت صدى MS 20-40، وسمك شريحة من 0،5-1،0 ملم، ومجال الرؤية من 12x10 ملم 2 مع حجم مصفوفة من 128x128 بكسل.
- للمعلمات elastography، ضبط تردد المحرك إلى القيمة التي يحددها Vibrometer الليزر وصف دوبلر. في الدراسة الحالية، كان هناك حاجة لثنائي القطب الزوج مع سعة التدرج من 50 سم / G. غيرها من المعالم لضبط وتشمل التأخير الذي يجب تعيين إلى الصفر ميلي ثانية لعملية الاستحواذ المبدئية.
- تغيير المولد وظيفة إلى انفجار الوضع وضبط المعلمات من المولد وظيفة لتتناسب مع تلك الموجودة في اكتساب المعلمات elastography بما في ذلك وتيرة وعدد من الدورات. أيضا، تعيين وظائفهاأن مولد نشوئها أثار خارجيا.
- للحصول على صورة السهمي، تعيين توعية اقتراح أن يكون في اتجاه إيجابي شريحة والبدء في عملية المسح. بعد عملية الاستحواذ، والتحقق من الصور وتغيير الاتجاه إلى توعية شريحة سلبي.
- تنفيذ برنامج MATLAB من شأنها أن تؤدي إلى تقسيم مجمع لتوليد صورة موجة القص.
- تقييم صورة عن وجود موجات القص والتحف ممكن مثل التفاف المرحلة.
- إذا لم يكن هناك تعديلات على صورة ضرورية، لضبط المعلمة حجم الصفيف إلى ثمانية القيم زمنية متساوية تتراوح بين صفر ثانية لفترة كاملة من تردد صدى تتميز.
- الحصول على المسح في كل من توجهات شريحة الإيجابية والسلبية.
- مرة واحدة يتم الحصول على الصور، واستخدام برنامج MATLAB مصممة لتوليد البيانات موجة القص من مجموعة من الصور.
4. التوعية من مخاطر الألغام معالجة التجربة صورة
- اله الخطوة النهائية من التوعية من مخاطر الألغام هو لحساب صلابة جز من الصور موجة القص. وضع البيانات في برنامج MATLAB الذي سيقيم مجموعة البيانات ثلاثية الأبعاد (2 المكانية، 1 الزمانية).
ملاحظة: بافتراض موجة القص المستوية، معادلات الفصل بين اقتراح السماح لتقدير معامل معقدة ذات القيمة القص بوصفها وظيفة من التشرد وLaplacian لها. الخوارزمية يقترب المشتقات الثانية المكانية مع اختلاف محدود، ويحسب معامل القص على أساس بكسل حسب بكسل. من هذا العدد معقدة، يمكن استنتاج الكثير من المعلمات الميكانيكية مثل سرعة موجة القص، وتخفيف موجة، وتصلب القص، ومرونة القص، واللزوجة القص، وما إلى ذلك الخوارزمية يتيح أيضا اختيار المناطق التي تهم التي والمتوسط والانحراف المعياري لل ويحسب كل معلمة.
- المعلمات التصوير تحتاج إلى تحديد في بداية البرنامج. بالإضافة إلى ذلك، الويمكن تعديل ه الحد الأعلى للelastogram لتحسين التباين في العينة.
ملاحظة: ويقدم البرنامج نتائج المتوسطة (بعد موجة المنخفضة تمرير المرشحات، وبعد موجة تصفية اتجاهي، الاتحاد الفرنسي للتنس الزمنية، وملامح خط، وغيرها) التي تساعد المستخدم على تقدير الاخلاص للانتعاش.
- ويمكن تعديل بعض المعلمات استنادا إلى هذه المعلومات، مثل مستويات المنخفضة تمرير المرشحات، وتواتر الزمني للحركة، في اتجاه انتشار الموجة، وما إلى ذلك الانحراف المعياري للمعلمة في منطقة محددة من الفائدة أيضا مؤشرا على نوعية العملية الحسابية.
5. ممثل النتائج
الشكل 4 يلاحظ التغير في الخواص الميكانيكية طوال أربعة أسابيع من تطوير التركيبة المكونة للعظم ومكون الشحم. وقد أجريت التوعية من مخاطر الألغام في 730-820 هرتز. في حين بدأ كل من الإسفنج المصنفة في ما يقرب من 3 كيلو باسكال، osteogeniج أدى الأنسجة الموجه في صلابة من 22 كيلو باسكال، في حين، توجه الأنسجة الدهنية انخفضت في صلابة إلى 1 كيلو باسكال. وعلاوة على ذلك، أظهرت البنى المكونة للعظم في انخفاض ملحوظ في حجم بالمقارنة من بدايتها وحتى نهاية الدراسة. وتظهر خصائص إضافية مستمدة من دراسة elastography في الجدول رقم 1.
الشكل 1. إن عملية الحصول على الصور لelastography بالرنين المغناطيسي. خلال الحصول على الصور، وتسلسل نبض (أ) تسيطر على التزامن (ب) من المولد وظيفة مع نبضات التدرجات بين القطبين من الماسح الضوئي التصوير بالرنين المغناطيسي. بعد الحصول على التدرجات القطبين مثبت في التوجهات الإيجابية والسلبية، (ج) يتم إنتاج صورة موجة القص باستخدام تقسيم معقد.
رسم بياني رقم 2 التدفق. عملية التوعية من مخاطر الألغام لمحرك الأنسجةالدو بنيات. أولا، وتزرع الخلايا 1 (أ) وتوسيعها لحجم السكان الأساسية للمشروع تصميم. ثم كانت الخلايا يتم تطبيقها المصنفة (ب) على سقالة بيولوجية والكواشف الكيميائية للإشارة إلى التمايز. وتتميز السقالات مع التوعية من مخاطر الألغام، الذي الخطوة الأولى (ج) هو تحديد تردد صدى من جانب المحرك للبناء. يتم الحصول المقبل، وصور الرنين المغناطيسي (د) لإنشاء صورة موجة القص (ه). أخيرا، يتم تطبيق خوارزمية لتسفر عن elastogram (و) أن خرائط وصلابة من بناء. في وقت واحد، هي ثوابت مقطوع لتقييم النسيجية (ز) من أجل التحقق من صحة التمايز.
الشكل 3. المحرك الداخلي التوصيف. تم تضمينه في سقالة الجيلاتين من هلام الاغاروز 0.5٪. لتوصيف حركة نقلهم الى عينة يتم إرسالها أولا الضوضاء البيضاء في النظام(1A)، ويتم الكشف عن الحركة الناتجة باستخدام الليزر دوبلر Vibrometer (1B). مرة واحدة يتم تحديد تردد رنين، إشارة والمستمر في صدى جيباني؛ شبه جيبي (2A) يتم إرسالها إلى تحديد الإزاحة (2B) نقلها إلى بيئة الجيلاتين.
الشكل 4. بانشاء خريطة التنمية خلال فترة أربعة أسابيع. وتظهر مكون الشحم (A) والمكونة للعظم (O) يبني من اليسار إلى اليمين مع حجم المقابل والصور موجة القص، elastogram، ومتوسط صلابة القص. وخارطة الألوان ليتوافق مع elastogram نظام الألوان على الرسم البياني للشريط وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري في كل منطقة التصور للاهتمام.
الجدول رقم 1. الخواص الميكانيكية للبنيات الدهنية وosteo خلال فترة أربعة أسابيع من النمو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا الإجراء، ويتجلى في عملية التوعية من مخاطر الألغام للبنيات الأنسجة المهندسة من إعداد الخلية إلى جيل من elastogram. من خلال تطبيق أسلوب تدميري تقييم الميكانيكية للأنسجة خط أنابيب والهندسة، وأصبح من الممكن الآن لتقييم التغييرات في البنى الهندسية طوال مراحل متعددة من التنمية. وبالإضافة إلى ذلك، يكمل غيرها من وسائل التوعية من مخاطر الألغام MR لرصد الأنسجة المهندسة ويبني مثل نشر ونقل مغنطة، والتحليل الكيميائي التحول 1.
عند إجراء التجارب التوعية من مخاطر الألغام، تجدر الإشارة إلى عدد قليل من القيود. تقييم العينات في المختبر هو دراسة وقت حساس. ولذلك، فمن المستحسن أن الدراسات يجب أن تستمر أكثر من ساعة واحدة بحيث يتم التقليل من أية أضرار محتملة على التركيبة الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتعرض للخطر الانتعاش المؤمنين من على الخريطة بسبب صلابة البنى أنها إما صغيرة جدا أو صلبة 6. فيه الحلول الممكنة لهذه المشكلة هو أن تعمل على التردد العالي (> 2،5 كيلو هرتز)، حيث أن الطول الموجي يتناسب عكسيا مع التردد. المحركات مكدس كهرضغطية يقودها مكبرات الجهد العالي قادرون على تقديم ما يكفي من الحركة في هذه الترددات لانتاج طول موجة القص كامل في العينة. آخر تعديل ممكن في البروتوكول هو استخدام أسرع سلاسل مثل سريع تدور الصدى والصدى مستو التصوير 11 و 12.
أبعد من إمكانيات تعليم مخاطر الألغام للبنيات الأنسجة هندسيا في المختبر، فإن الخطوة التالية من مرحلة ما قبل السريرية التقييم هو تقييم تطور الأنسجة المزروعة في نظام المعيشة. فإن تطبيق التوعية من مخاطر الألغام إلى دراسات الماوس فرصة أخرى لتقييم غير بشكل هدام في تطوير البنى الأنسجة. وتمديد elastography لتلقي العلاج من العظم أو الغضروف عيوب محتملة توفير فهم أفضل لكيفية إنتاج أطول أمدا و يزرع وظيفيأو استخدامها في الطب التجديدي. المغناطيسي elastography صدى لديه القدرة على لعب دور متزايد في التحقق من التركيبات الهندسية سواء في التجارب المختبرية والحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث في جزء من المعاهد الوطنية للصحة RO3-EB007299-02 وجبهة الخلاص الوطني EPSCoR الجائزة الأولى.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MSCGM-Bullet Kit | Reagent | Lonza Inc. | PT-3001 | Store at 4°C |
| 1X DPBS | Reagent | Invitrogen | 21600-010 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | Store at -20°C |
| Dexamethasone | Reagent | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Reagent | Sigma-Aldrich | I5879 | Store at -20°C |
| Insulin-bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I6634 | Store at -20°C |
| Indomethacin | Reagent | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Β-Glycerophosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Gelfoam | Scaffold | Pharmacia Corporation (Pfizer) | 09-0315-08 | |
| Human mesenchymal stem cells | Cell Line | Lonza Inc. | PT-2501 | |
| 9.4T MR Scanner | Equipment | Agilent Technologies | 400MHz WB | |
| 10mm Litz Coil | Equipment | Doty Scientific | ||
| Laser Doppler Vibrometer | Equipment | Polytec | PDV-100 | |
| Vibrosoft (20) | Software | Polytec | ||
| Function generator | Equipment | Agilent Technologies | AFG 3022B | |
| Amplifier | Equipment | Piezo Inc. | EPA-104-115 | |
| Piezo Bending motor | Equipment | Piezo Inc. | T234-A4Cl-203X | |
| Computer-Linux | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| Computer-Windows | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| MATLAB | Software | Mathworks | 2009b |
References
- Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging. J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).
- Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro. Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).
- Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE. Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).
- Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves. Science. 269, 1854-1857 (1995).
- Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs. NMR Biomed. , Forthcoming (2011).
- Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation. Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).
- Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test. Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).
- Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge. Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).
- Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression. Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).
- Marion, N. W., Mao, J. J. Mesenchymal stem cells and tissue engineering. Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).
- Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain. Proceedings of the International Society of Magnetic Resonance in Medicine, Glasgow, Scotland, , 1647-1647 (2001).
- Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. Fast EPI based 3D MR elastography of the brain. Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine, Seattle, Washington, , 3385-3385 (2006).
