Summary
절차는 지방과 미세한 자기 공명 elastography (μMRE)를 사용하여 기계적 성질의 비침 투 현지 심사를 통해 osteogenic 조직 공학 구조의 공학 결과를 모니터링하기위한 자기 공명 elastography의 방법론을 보여줍니다.
Abstract
전통적인 기계적인 테스트는 종종 시료의 파괴에 결과 및 연구를 구축 설계 장기적인 조직의 경우에는 파괴적인 평가의 사용은 허용되지 않습니다. 제안된 대안은 자기 공명 elastography라는 이미징 프로세스의 사용이다. Elastography는 조직의 구조와 기능을 식별하는 데 필수 마커가 지방 기계적 성질 값 (즉, 복합 전단 계수)를 측정하여 공학 결과를 결정하기위한 비파괴 방법입니다. 평가를위한 비침 투 수단으로서, 그러한 자기 공명 영상 (MRI)와 같은 이미징 modalities와 엔지니어링 구조의 모니터링은 지난 10 년 1 증가하고 관심을 보여줬습니다. 예를 들어, 보급 및 relaxometry의 자기 공명 (MR) 기술은 엔지니어링 조직 개발이 중 화학 및 물리적 특성의 변화를 특징 짓는 수 있었다. 에서 제안된 방법다음과 같은 프로토콜이 작은 부드러운 조직 3의 기계적 성질을 측정하는 비침 투 MR 기반 기술로 미세한 자기 공명 elastography (μMRE)를 사용합니다. MRE (군용 식품)은 관심의 조직과 음파 기계 액츄에이터를 커플링 및 MR 스캐너 4 전단 웨이브 전파를 기록함으로써 이루어진다. 최근 μMRE은 전통적으로 파괴적인 기계 매크로 기법 5를 사용하여 측정하는 필수적인 성장 정보를 얻기 위해 조직 공학에 적용되었습니다. 다음 절차에서는 elastography는 기계식 액추에이터와 결합 수정 돼야 해 한이 스핀 - 에코 시퀀스와 엔지니어링 구조의 영상을 통해 이루어진다. 그림 1에 나타난 바와 같이, 수정된 순서는 외부 전단 파도의 전송과 이미지 수집을 동기화, 이후, 움직임은 바이폴라 쌍을 진동을 통해 sensitized입니다. 긍정적이고 부정적인 움직임 sensitiza와 이미지의 수집을 따라데이터의 기, 복잡한 부서는 전단 파 이미지를 생성합니다. 그런 다음 이미지가 전단 강성지도 6 생성 반전 알고리즘을 사용하여 평가된다. 각 voxel의 결과로 성능은 강력하게 데이터를 동적 기계적 분석 7을 사용 회수와 함께 (R 2> 0.9914) 상관 관계를 보여왔다. 본 연구에서는 elastography는 그림 2에 표시된 adipogenic과 osteogenic 구조로 인간 mesenchymal 줄기 세포 (H MSC) 차별 모니터링을위한 조직 개발 과정에 통합되어 있습니다.
Protocol
1. 조직 구조 준비
조직은 준비 과정을 구성하는 세 가지 주요 단계로 구성되어 화학 신호 분자의 사용을 통해 세포 인구의 팽창, biomaterial 발판 진입 세포 퍼뜨리고, 그리고 차별화. 구조 준비 절차는 데니스 외., 홍콩 외., 그리고 메리 언과 마오 8,9,10 실시 방법에 따라 달라집니다.
- 문화와 세포 라인의 확장, 종자 뼈 및 3x10 6 셀 / ML에 대한 1x10 6 셀 / ML의 밀도에 젤라틴 스폰지 진입 인간 mesenchymal 줄기 세포 (H MSCS) (4 밀리미터 직경 3.5 밀리미터 두께)에 대한 후 지방 형성.
- 지방에 H MSCS의 차별 화를 위해, 셀 확장 매체에 1 μm의의 dexamethasone, 0.5 μm의 이소 부틸-methylxanthine, 10 μg / ML 인간 재조합 - 인슐린, 200 μm의 제품 인도 메 타신 구성된 지방 유도 매체를 적용일단 세포가 발판에 합류 나타납니다. 사흘 뒤에, 10 μg / 24 시간 동안 확장 매체에서 인간 재조합-인슐린 ML 후 유도 매체로 돌아가 함께 미디어를 교체하십시오. 주기를 세 번 반복하고 이틀 유지 보수 언론에서만 교환.
- osteogenesis를 유도하기 위해, 0.1 μm의의 dexamethasone, L-아스코르비 산 - 2phosphate 50 μm의, 그리고 셀 확장 매체에서 10 밀리미터 β-glycerophosphate의 최종 농도함으로써 osteogenic 유도 미디어를 준비합니다. 신선한 osteogenic 미디어 이틀로 바꿉니다.
2. 액추에이터 특성화
액츄에이터의 특성은 MRE (군용 식품)의 실험을위한 중요한 단계입니다. MRE (군용 식품)는 기계적 특성의 로컬 값을 평가하기 위해 기계적인 전단 파도의 전파에 의존하므로 이러한 기계적 진동이 압전 액츄에이터를 사용하여 관심있는 조직 내에서 생성 및 특성화해야합니다. 그림 EXA특성화 과정의 mple은 그림 3에 표시됩니다. 이 절차의 목표는 상당한 amplitudes (~ 250 미크론)에 무해한 전단 파도를 생성하기 위해 액츄에이터의 움직임을 최적화하는 것입니다.
- 실험에 앞서, 10mm 테스트 튜브 구조를 묶으 0.5 % 아가로 오스 겔을 적용합니다. 겔의 온도는되어야 약 37 ° C 구조에 손상을 최소화합니다.
- 아가로 오스 겔 오분은 실온에서 설정할 수 있도록하면 젤의 표면에 압전 굽힘 모터의 끝부분을 삽입합니다.
- 엄격한 지원 샘플 및 액츄에이터를 포함한 튜브를 부착하고, 동양 기계 액츄에이터의 끝 방향으로 레이저 도플러 진동계의 빔. 필요한 경우 반사 신호를 최적화하는 시스템의 위치를 조정, 반사 테이프를 사용합니다.
- 기계식 액추에이터의 예상 공진 주파수를 바탕으로 d를 청소하기 위해 함수 발생기를 설정백색 잡음 신호와 함께 20 VPP의 작동 전압을 사용하여 esired 주파수 범위 (즉, 본 실험에서는 20-2000 Hz에서).
- 시스템의 공진 주파수를 식별하고 y 축은로 FFT와 속도로 프로그램을 설정하는 Polytec Vibrosoft 프로그램을 특성화 스펙트럼을 봅니다.
- 변위 측정을위한 200 VPP의 작동 전압을 사용하여 지정된 공진 주파수에서 연속적인 정현파를 제공하기 위해 액츄에이터를 설정하고, 젤의 표면에 전달되는 생성된 변위를 적어 둡니다. y 축은 같은 변위와 FFT를 표시 Vibrosoft을 설정합니다.
3. 이미지 수집
- 액추에이터 특성화 완료 후 MRI 스캐너의 중앙에있는 샘플 및 액추에이터를 놓습니다. 조직 구조 실험의 경우 RF 신호의 전송 및 수신을위한 작고 더 민감한 RF 코일 (이 실험에서 즉 10mm)을 사용합니다. (표시된 절차는 9.4 T를 사용하여수직 구멍 자석은 삼중 축 기울기, 100 G / ㎝)가 장착되어.
- 구조 위치의 식별을위한 정찰 이미지를 취득.
- 인수에 대한 매개 변수를 설정합니다. 체외 화살 검사에서 전형적인 1000 MS, 20-40 MS, 0.5-1.0 mm와 128x128 픽셀의 매트릭스 크기가 12x10 mm 2의 전망 분야의 슬라이스 두께의 반향 시간의 반복 시간을해야합니다.
- elastography 매개 변수의 경우 레이저 도플러 진동계의 특성에 의해 결정 값으로 액추에이터 주파수를 설정합니다. 현재 학문에서는, 바이폴라 쌍은 50 G / cm의 기울기 진폭으로 필요했다. 조정하는 다른 매개 변수는 초기 취득 제로 밀리초로 설정해야 지연을 포함합니다.
- 모드를 파열과 주파수 및주기의 수를 포함하여 elastography 인수 매개 변수에서 일치하도록 함수 발생기의 매개 변수를 조정하기 위해 함수 발생기를 변경합니다. 또한, FUNC을 설정기 발전기는 외부 트리거해야합니다.
- 화살 이미지, 긍정적인 슬라이스 방향이어야하며 스캔을 시작 모션 sensitization을 설정합니다. 취득 후, 이미지를 확인하고 부정적인 슬라이스 방향으로 sensitization을 변경합니다.
- 전단 파 이미지의 생성을 위해 복잡한 분할을 수행합니다 MATLAB 프로그램을 실행합니다.
- 전단 파도와 같은 위상 포장 가능한 유물의 존재에 대한 이미지를 평가합니다.
- 이미지에 어떤 조정이 필요 없다면 0 초에서 특징인 공명 주파수의 전체 기간에 이르기까지 여덟 동일 간격 값으로 매개 변수 배열의 크기를 조정합니다.
- 긍정과 부정적인 슬라이스 방향 모두에서 스캔을 습득.
- 이미지가 획득되면, 이미지의 배열에서 전단 웨이브 데이터 생성을위한 MATLAB 프로그램을 사용합니다.
4. MRE (군용 식품) 실험 영상 처리
- 일MRE (군용 식품)의 전자 마지막 단계는 가위 웨이브 이미지에서 전단 강성을 계산하는 것입니다. 입체 데이터 세트 (2 공간적, 1 현세)을 평가할 것입니다 MATLAB 프로그램에 데이터를 배치.
참고 : 평면 전단 파, 변위 및 라플라스의 함수로 복잡한 - 가치 전단 계수의 평가를 허용 모션 decouple의 방정식을 가정함으로써. 알고리즘은 유한 차와 공간적 초 파생 상품을 대략하고 픽셀별로 픽셀 단위로 전단 계수를 계산합니다. 이 복잡한 숫자에서 많은 기계적인 매개 변수는 알고리즘도 허용 등의 전단 파 속도, 전파 감쇠, 전단 강성, 전단 탄성, 전단 점도 등의 추론 수있는 관심 영역의 선정있는 대한의 평균 및 표준 편차 각 매개 변수가 계산됩니다.
- 이미징 매개 변수는 프로그램의 시작 부분에 지정해야합니다. 또한, 일elastogram의 전자 상한은 샘플에서 명암을 최적화하기 위해 조정할 수 있습니다.
참고 :이 프로그램은 사용자가 복구 신실을 추정하는 데 도움이 중간 결과 (로우 패스 필터 후 파도 방향 필터링, 현세의 FFT, 라인 프로파일 등 뒤에 파도)을 제공합니다.
- 일부 매개 변수는 이러한 관심의 특정 지역에서 매개 변수의 표준 편차는 로우 - 패스 필터, 운동의 시간적 주파수, 전파의 전파의 방향 등의 수준으로이 정보를 기반으로 조정할 수 있습니다 또한 계산의 품질 지표.
5. 대표 결과
그림 4는 메모 osteogenic 및 adipogenic 구조 개발 4 주 전역의 기계적 성질의 변화. MRE (군용 식품)는 730-820 Hz에서 실시되었다. 두 씨앗을 품고 스폰지는 약 3 kPa, osteogeni에서 시작하는 동안C 감독의 조직은 22 kPa의 강성 결과, 지방은 1 kPa까지 강성으로 감소 조직을 감독, 반면. 또한, osteogenic 구조가 연구의 처음부터 끝까지 비해 크기가 주목할만한 감소를 보여주었다. elastography 연구에서 파생된 추가적인 특성은 표 1에 표시됩니다.
그림 1. 자기 공명 elastography위한 이미지 수집 과정입니다. 이미지 수집하는 동안 펄스 시퀀스 ()는 (b)는 MRI 스캐너의 양극성 그라디언트 펄스와 함수 발생기의 동기화를 제어합니다. 긍정적이고 부정적인 방향으로 토글 양극성 그라디언트 취득 후, (다) 전단 파 이미지는 복잡한 분할을 사용하여 생산하고 있습니다.
조직 엔진 MRE (군용 식품) 과정을 그림 2. 흐름 다이어그램ered 구조. 첫째, 세포 ()는 첫번째 재배 및 설계 프로젝트를위한 필수적인 인구의 크기로 확대됩니다. 그렇다면 전지 biomaterial 비계 및 화학 시약쪽으로 씨앗 (B)가 분화 신호를 적용합니다. 공사장 공중 발판은 그의 첫 번째 단계 (C) 구조로 결합 액츄에이터의 공진 주파수의 결정이다 MRE (군용 식품)와 특징. 다음으로, MRI 영상 (D)은 전단 파 이미지 (E)를 생성하기 위해 찾았습니다. 마지막으로, 알고리즘은 elastogram를 얻을 수에 적용됩니다 (F) 매핑 구조의 강성. 동시에, 구조는 차별의 유효성을 검사하기 위해 histological 평가 (G)에 대해 sectioned 있습니다.
그림 3. 액츄에이터 특성화 절차. 젤라틴 발판은 0.5 % 아가로 오스 겔에 의해 포함되어 있습니다. 샘플로 전송되는 움직임을 특성화하기 위해 화이트 노이즈가 먼저 시스템에 전송됩니다(1A) 및 결과 동의안은 레이저 도플러 진동계 (1B)를 사용하여 감지됩니다. 공진 주파수가 결정되면 공명의 연속 정현파 신호 (2A) 젤라틴 환경에 전송된 변위를 (2B) 결정하기 위해 전송됩니다.
그림 4. 사주 기간 동안 개발지도를 구축. Adipogenic ()과 osteogenic (O) 구조가 왼쪽에서 해당 크기 및 전단 파 이미지, elastogram, 평균 전단 강성과 오른쪽에 표시됩니다. 막대 차트와 오차 막대의 색 구성표와 elastogram에 해당위한 colormap 관심의 각 구조의 영역 내에서 표준 편차를 나타냅니다.
표 1. 성장의 4 주간의 기간 동안 지방과 osteo 구조의 기계적 성질.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 절차에서는 조직 공학 구조를위한 MRE (군용 식품)의 과정은 세포 준비 과정에서 elastogram의 세대 증명하고 있습니다. 조직 엔지니어링 파이프라인에 비파괴 기계적 평가 방법을 적용함으로써, 개발의 여러 단계에 걸쳐 엔지니어링 구조의 변화를 평가하는 지금은 가능합니다. 조작 모니터링 조직 등 확산, 자화 전송, 화학 시프트 분석 1로 구성하고 위해 또한, MRE (군용 식품)는 다른 MR 방식을 보완합니다.
MRE (군용 식품) 실험을 수행할 때 몇 가지 제한 사항이 언급되어야한다. 시험 관내 표본에의 평가는 시간에 민감한 연구입니다. 따라서, 그것은 조직 구조에 대한 어떠한 잠재적인 손상이 최소화되도록 연구가 더 이상 하나가 아닌 시간을 지속해야하는 것이 좋습니다. 또한 강성지도의 충실 복구는 6 너무 작거나 뻣뻣한 하나되는 구조로 인해 손상된 수 있습니다. 에파장은 주파수에 반비례로이 문제에 대한 전자 가능한 솔루션은 높은 주파수 (> 2.5 kHz에서)에서 작동하는 것입니다. 고전압 앰프에 의해 구동 압전 스택 액츄에이터는 예제의 전체 전단 파장을 생산하기 위해 같은 주파수에서 충분한 운동을 제공할 수 있습니다. 프로토콜에 대한 또 다른 가능성 개정안은 스핀 - 에코 빠르고 에코 평면 영상 11, 12와 같은 더 빠른 시퀀스를 사용하는 것입니다.
체외에서 조직 설계 구조를위한 MRE (군용 식품)의 가능성 이외에도, 사전 임상 평가의 다음 단계는 살아있는 시스템으로 이식 조직의 발전을 평가하는 것입니다. 마우스 연구에 대한 MRE (군용 식품)의 응용 프로그램은 nondestructively 개발 조직 구조를 평가하는 또 다른 기회를 제공할 것이다. 뼈 또는 연골 결함의 치료를 위해 elastography의 연장 가능성이 더 오래 지속 기능성 임플란트의 F를 생산하는 방법에 대한 이해를 제공할 것이다또는 재생 의료에 사용합니다. 자기 공명 elastography는 시험 관내 및 생체내의 두 공학 구조의 검증에 증가 역할을 할 잠재력을 가지고 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자가 공개하는 흥미 아무런 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH RO3-EB007299-02 및 NSF EPSCoR 첫 수상에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MSCGM-Bullet Kit | Reagent | Lonza Inc. | PT-3001 | Store at 4°C |
| 1X DPBS | Reagent | Invitrogen | 21600-010 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | Store at -20°C |
| Dexamethasone | Reagent | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Reagent | Sigma-Aldrich | I5879 | Store at -20°C |
| Insulin-bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I6634 | Store at -20°C |
| Indomethacin | Reagent | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Β-Glycerophosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Gelfoam | Scaffold | Pharmacia Corporation (Pfizer) | 09-0315-08 | |
| Human mesenchymal stem cells | Cell Line | Lonza Inc. | PT-2501 | |
| 9.4T MR Scanner | Equipment | Agilent Technologies | 400MHz WB | |
| 10mm Litz Coil | Equipment | Doty Scientific | ||
| Laser Doppler Vibrometer | Equipment | Polytec | PDV-100 | |
| Vibrosoft (20) | Software | Polytec | ||
| Function generator | Equipment | Agilent Technologies | AFG 3022B | |
| Amplifier | Equipment | Piezo Inc. | EPA-104-115 | |
| Piezo Bending motor | Equipment | Piezo Inc. | T234-A4Cl-203X | |
| Computer-Linux | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| Computer-Windows | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| MATLAB | Software | Mathworks | 2009b |
References
- Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging. J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).
- Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro. Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).
- Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE. Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).
- Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves. Science. 269, 1854-1857 (1995).
- Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs. NMR Biomed. , Forthcoming (2011).
- Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation. Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).
- Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test. Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).
- Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge. Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).
- Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression. Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).
- Marion, N. W., Mao, J. J. Mesenchymal stem cells and tissue engineering. Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).
- Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain. Proceedings of the International Society of Magnetic Resonance in Medicine, Glasgow, Scotland, , 1647-1647 (2001).
- Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. Fast EPI based 3D MR elastography of the brain. Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine, Seattle, Washington, , 3385-3385 (2006).
