O Ensaio neuroblasto: um ensaio para a Geração e Enriquecimento de células progenitoras neuronais de Diferenciando Progeny Neural Stem Cell utilizando citometria de fluxo
Summary
Este protocolo de vídeo demonstra um novo método para a geração e subsequente purificação de células progenitoras neuronais a partir de uma fonte renovável de células estaminais neurais (NSCs) com base na sua (granulosidade tamanho e interno) física e propriedades fluorescentes usando tecnologia de citometria de fluxo.
Abstract
As células estaminais neurais (NCCC) podem ser isoladas e expandidas em grande escala, utilizando o ensaio de neuroesfera e diferenciados para as três principais tipos de células do sistema nervoso central (SNC), ou seja, astrócitos, oligodendrócitos e neurónios. Estas características tornam haste neural e células progenitoras uma valiosa fonte renovável de células para estudos in vitro, como o rastreio de drogas, neurotoxicologia e electrofisiologia e também para a terapia de substituição de células em muitas doenças neurológicas. Na prática, contudo, a heterogeneidade da NSC descendência, baixa produção de neurónios e oligodendrócitos, e uma predominância de astrócitos seguintes diferenciação limitar as suas aplicações clínicas. Aqui, descrevemos uma nova metodologia para a purificação e posterior geração de neurônios imaturos da descendência NSC murino usando separação de células activadas por fluorescência (FACS) da tecnologia. Utilizando esta metodologia, uma população altamente enriquecida de células neuronais progenitoras pode ser conseguida witHout qualquer astrócitos perceptível e bona fide contaminação NSC. O procedimento inclui a diferenciação de NSC progenitura isoladas e expandidas a partir de E14 eminências rato ganglionares utilizando o ensaio neuroesfera, seguido por isolamento e enriquecimento de células neuronais imaturos com base nas suas propriedades físicas (tamanho e complexidade interna) e fluorescente utilizando a tecnologia de citometria de fluxo. Em geral, leva-se 5-7 dias para gerar neuroesferas e 6-8 dias para diferenciar progenitura NSC e isolar altamente purificada imaturos células neuronais.
Protocol
Discussion
A capacidade de isolar populações definidas de células neurais (neurônios, ou seja, astrócitos e oligodendrócitos) pode resolver alguns dos impedimentos associados à aplicação clínica de células-tronco neurais (NSCs). Em primeiro lugar, permite-nos para caracterizar completamente a população inicial de células do doador. Em segundo lugar, nos permite usar um tipo particular de célula ou uma combinação de diferentes tipos de células com um rácio específico, dependendo da natureza ou da fase da doença…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi suportado pelo financiamento da Fundação Overstreet.
Materials
| Name of the reagent | Tipo | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
Riferimenti
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
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