Нейробластов Анализ: Анализ для создания и обогащения нейронов клетки-предшественники из Дифференцируя нейронных потомков стволовых клеток методом проточной цитометрии

Summary

Это видео демонстрирует протокол новый метод генерации и последующей очистки нейронных клеток-предшественников из возобновляемых источников нервные стволовые клетки (НСК) на основе их физических (размер и внутренней детализации) и флуоресцентные свойства с помощью технологии проточной цитометрии.

Abstract

Нервные стволовые клетки (НСК) могут быть выделены и расширен в больших масштабах, используя neurosphere анализа и дифференцированы на три основных типа клеток центральной нервной системы (ЦНС), а именно астроциты, олигодендроциты и нейроны. Эти характеристики делают нейронных стволовых и прогениторных клеток бесценный возобновляемый источник клеток для лабораторного исследования, такие как наркотики, Нейротоксикология и электрофизиологии, а также для мобильных заместительной терапии при многих неврологических заболеваний. На практике, однако, неоднородность НСК потомство, низкое производство нейронов и олигодендроцитов и астроцитов преобладание после дифференциации ограничить их клинического применения. Здесь мы описываем новую методологию для создания и последующей очистки незрелых нейронов с мышиным потомством НСК активировать с помощью флуоресцентной сортировки клеток (FACS) технологии. Используя эту методологию, обогащенного нейронные популяции клеток-предшественников может быть достигнут умомHout заметного астроцитов и добросовестных загрязнения НСК. Процедура включает в себя дифференциацию НСК потомство изолированы и расширен с E14 мыши ганглиозные возвышения использованием neurosphere анализа, с последующим выделением и обогащение незрелых нервных клеток в зависимости от их физических (размер и внутреннюю сложность) и флуоресцентные свойства с помощью технологии проточной цитометрии. В целом, это занимает 5-7 дней для получения нейросферы и 6-8 дней, чтобы дифференцировать НСК потомство и изоляции высокоочищенных незрелых нервных клеток.

Protocol

1. Основная настройка Прежде чем приступить к культуре клеток NeuroCult НСК базальной среды и NeuroCult НСК распространения добавки смешиваются в соотношении 9:1, соответственно, сделать полный среднего НСК. 37 ° С водяной бане используется для разогрева среды. Соответствующее ко…

Discussion

Возможность изолировать определенный нейронных клеточных популяций (например, нейроны, астроциты и олигодендроциты) может решить некоторые из препятствий, связанных с клиническим применением нервные стволовые клетки (НСК). Во-первых, она позволяет нам в полной мере характеризуют нач?…

Materials

Name of the reagent	Tipo	Company	Catalogue number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
%0.05    trypsin-EDTA	Reagent	Gibco	25300-062
Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma	T6522
Pen/Strep	Reagent	Gibco	15140-122
*MEM	Reagent	Gibco	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	Gibco	15230-147
Cell strainer	Sieve	BD Falcon	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Falcon	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Falcon	352070
EGF	Growth factor	R&D	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma	H4784	Reconstituted in PBS
Anti-PSA-NCAM-PE	Antibody	Miltenyi Biotec	130-093-274
PE- Conjugated mouse IgG1	Isotype control antibody	BD Pharminogen	556029
Heparin	Growth factor	Sigma	H4784	Reconstituted in PBS
HrBMP-4	Growth factor	R&D	314-BP-010
Poly-L-Ornithine	Reagent	Sigma	P4957
Fetal Calf Serum	Medium Supplement	Gibco	10099-141
GFAP	Antibody	DAKO	Z0334
B-III tubulin	Antibody	Promega	G7121

*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.