Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo
Summary
Presentiamo un metodo per formare una finestra di imaging nel cranio topo che si estende millimetri ed è stabile per mesi senza infiammazione cerebrale. Questo metodo è adatto per studi longitudinali di flusso sanguigno, dinamica cellulare, e cellule / struttura vascolare con microscopia a due fotoni.
Abstract
In vivo imaging della funzione corticale richiede l'accesso ottico al cervello senza interruzioni dell'ambiente intracranica. Vi presentiamo un metodo per formare un cranio lucido e rinforzato diluito (porte) finestra nel cranio del mouse che si estende su parecchi millimetri di diametro ed è stabile per mesi. Il cranio è diluito a 10 a 15 pm di spessore con una mano trapano per ottenere chiarezza ottica, e viene poi ricoperto con colla di cianoacrilato e un vetro di copertura a: 1) fornire rigidità, 2) inibiscono la ricrescita ossea e 3) ridurre la dispersione della luce da irregolarità sulla superficie dell'osso. Dal momento che il cranio non è violato, qualsiasi infiammazione che potrebbe influenzare il processo in fase di studio è notevolmente ridotto. Imaging profondità fino a 250 um sotto la superficie corticale può essere realizzato utilizzando due fotoni microscopia a scansione laser. Questa finestra è particolarmente adatta a studiare il flusso ematico cerebrale e la funzione cellulare in preparazioni sia anestetizzati e sveglio. Offre inoltre l'opportunità di manipolare l'attività delle cellule utilizzando optogenetics o per interrompere il flusso di sangue nei vasi destinatari irradiazione di circolazione fotosensibilizzanti.
Protocol
Discussion
Two-photon immagini attraverso una finestra Porte richiede la trasmissione attraverso l'osso assottigliata e la dura madre, che attenua la luce laser e aggiunge aberrazioni ottiche a maggiori profondità 8. Tuttavia, nonostante questo inconveniente, profondità di imaging fino a 250 um sotto la superficie piale può essere ottenuto con eccitazione 900 nm. Profondità maggiori di imaging possono in linea di principio essere possibile con lunghezze d'onda di eccitazione più 13. Un importante…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association (Post-doctoral fellowship a AYS) e il National Institutes of Health (MH085499, EB003832 e OD006831 a DK). Ringraziamo Beth Friedman e Pablo Blinder per i commenti sul manoscritto.
Materials
| Agent | Route of delivery | Dose for mouse | Duration | Notes | Source | Ref Ref |
| Pentobarbital (Nembutal) | IP | 90 μg/g | 15-60 min | Narrow safety margin. Work up to proper dose of anesthesia slowly. Supplement 10 % of induction dose as required. | 036093; Butler Schein | 7 |
| Ketamine (Ketaset) mixed with Xylazine (Anased) | IP | 60 μg/g (K)
10 μg/g (X) (mix in same syringe) |
20-30 min | Xylazine is co-injected as a muscle relaxant and analgesic. Supplement only Ketamine at 50% of induction dose as required. | (K) 010177, (X) 033198; Butler Schein | 7 |
| Isoflurane (Isothesia) | Inhalation | 4% mean alveolar concentration (MAC) for induction; 1-2% MAC for maintenance | 4-6 h. | Provided in mixture of 70% oxygen and 30% nitrous oxide. Prolonged anesthesia leads to slow recovery. | 029403; Butler Schein | 26 |
Table 1. Suggested anesthetic agents for survival studies.
| ITEM | COMPANY | CATALOG # / MODEL |
| Betadine | Butler Schein | 6906950 |
| Buprenorphine (Buprenex) | Butler Schein | 031919 |
| Fluorescein isothiocyanate dextran, 2 MDa molecular weight | Sigma | FD2000S |
| Isopropyl alcohol | Fisher | AC42383-0010 |
| Lactated Ringer’s Solution | Butler Schein | 009846; |
| Lidocaine solution, 2 % (v/v) | Butler Schein | 002468 |
| Saline | Butler Schein | 009861 |
| Surgical Milk | Butler Schein | 014325 |
| Texas Red dextran, 70 kDa molecular weight | Invitrogen | D1864 |
| Maxizyme | Butler Schein | 035646 |
| DISPOSABLES | ||
| Carbide burrs, 1/2 mm tip size | Fine Science Tools | 19007-05 |
| Cottoned tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-100 |
| Cover Glass, no. 0 thickness | Thomas Scientific | 6661B40 |
| Cyanoacrylate glue | ND Industries | 31428 H04308 |
| Gas duster | Newegg | N82E16848043429 |
| Grip cement powder | Dentsply | 675571 |
| Grip cement solvent | Dentsply | 675572 |
| Insulin syringe, 0.3 mL volume with 29.5 gauge needle | Butler Schein | 018384 |
| Nut and bolt to secure the head | Digikey | Nut, H723-ND; bolt, R2-56X1/4-ND |
| Opthalmic ointment | Butler Schein | 039886 |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | 12-460-448 |
| Screws, self-tapping #000 | J.I. Morris Company | FF000CE125 |
| Silicone aquarium sealant | Perfecto Manufacturing | 31001 |
| Tin oxide powder | Mama’s Minerals | EQT-TINOX |
| EQUIPMENT | ||
| Glass scribe | Fisher Scientific | 08-675 |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | OPMI-1 FC |
| Electric powered drill | Foredom or Osada | K.1020 (Foredom) or EXL-M40 (Osada) |
| Electrical razor | Wahl | Series 8900 |
| Forceps, Dumont no. 55 | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Feedback regulated heat pad | FHC | 40-90-8 (rectal thermistor, 40-90-5D-02; heat pad, 40-90-2-07) |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | IsoTec4 |
| Pulse oximeter | Starr Life Sciences | MouseOx |
| Screwdriver, miniature | Garret Wade | 26B09.01 |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 (with mouse anesthesia mask and non-rupture ear bars) |
| Surgical scissors, blunt end | Fine Science Tools | 14078-10 |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | 15-335-30 |
Table 2. List of specific reagents, disposables and equipment.
Riferimenti
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