定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出
Summary
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）は、腫瘍サンプル中の様々なマイクロRNA（miRNA）分子の発現レベルを調査するために迅速かつ高感度な方法です。異なるmiRNA分子の何百ものこのメソッド式を使用して、増幅定量化し、同じcDNAをテンプレートから分析することができます。
Abstract
マイクロRNA（miRNA）は、一本鎖、18から24ヌクレオチド長、非コーディングRNA分子である。彼らは、開発1、アポトーシス2、および細胞周期の調節3を含むほぼすべての細胞プロセスに関与している。 miRNAはそのターゲットメッセンジャーRNA（mRNA）5に結合することにより、ヒト遺伝子の30％〜90％4の発現を調節すると推定されている。 miRNAの広範囲の調節不全は、様々な疾患や癌のサブタイプ6で報告されています。その有病率とユニークな構造により、これらの小分子は、バイオマーカー、治療薬および/またはターゲットの次の世代になる可能性があります。
miRNAの発現を調べるために使われるメソッドは、SYBR Green I色素をベースと同様のTaqManプローブベース定量PCRが含まれています。 miRNAが効率的に臨床の現場で使用する場合は、それが新鮮な、そして/または、アーカイブされた臨床検体での検出は、正確な再現性、およびspであることが不可欠であるecific。定量PCRは、広くこのようなマイクロアレイ研究7などの全ゲノム解析におけるmiRNAの発現を検証するために使用されています。このプロトコルで使用されているサンプルは、臨床的限局性前立腺癌に対する根治的前立腺摘除術を施行した患者からのものであった。しかし、他の組織や細胞株は、切除した後に液体窒素で瞬間凍結した前立腺標本インチ置換することができます。臨床的変数とそれぞれの患者のフォローアップ情報は、その後の分析8に収集した。
前立腺腫瘍サンプル中のmiRNAレベルの定量化 。腫瘍の定量PCR解析の主な手順は次のとおりです。トータルRNA抽出、cDNA合成、およびmiRNA特異的プライマーを用いた定量PCR産物の検出。 mRNAは、miRNAの、および他のsmall RNAを含むトータルRNAは、TRIzol試薬を用いて検体から抽出した。キアゲンのmiScriptシステムはcDNAを合成し、定量PCR（ 図1）を実行するために使用されていました。内因性miRNAはPOではありません逆転写の過程で、したがって、lyadenylated、ポリ（A）ポリメラーゼがmiRNAをpolyadenylates。 miRNAはオリゴdTと逆転写酵素を用いてcDNAを合成するためのテンプレートとして使用されています。 oligo-dTプライマーの5 '末端に普遍的なタグ配列は、PCRのステップでcDNAの増幅を容易にします。 PCR産物の増幅は、SYBRグリーン、二本鎖DNAにインターカレート色素が発する蛍光のレベルで検出されます。ユニバーサルタグ配列に結合するユニバーサルプライマーと一緒に特定のmiRNAのプライマーは、特定のmiRNAの配列を増幅します。
miScriptプライマーアッセイは、千以上の人間に固有のmiRNA、およびマウス固有のmiRNAの何百もご利用いただけます。相対定量法はmiRNAの発現を定量化するためにここで使用されていました。異なるサンプル間のばらつきを補正するために、ターゲットのmiRNAの発現レベルは、基準遺伝子の発現レベルに正規化されています。 GEの選択ターゲットの表現を正規化するのNEは、分析の相対定量法では非常に重要です。彼らは安定してほとんどのサンプルを越えて発現していることが考えられているとして、通常、この容量で使用されているリファレンス遺伝子の例としては、RNU6B、RNU44、とRNU48の小さなRNAである。このプロトコルでは、RNU6Bを参照遺伝子として使用されます。
Protocol
Discussion
正常組織10に比較した場合、いくつかのmiRNAの異常な表現が一貫して前立腺腫瘍で発見されており、これらのmiRNAのいくつかは、前立腺癌11に対する潜在的な新規治療薬として名指しされている。したがって、miRNAの異常な発現レベルは、有用な診断および/または予後バイオマーカーにすることができます。ここで紹介するリアルタイム定量PCR手法は、前立腺腫瘍組織におけるm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、カナダの癌協会研究所、助成金なしで資金を供給された。 019038。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | |
| Light Cycler Capillaries | Roche | 04929292001 |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | 2538 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
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