Détection MicroRNA dans les tumeurs prostatiques par quantitative PCR en temps réel (qPCR)
Summary
Quantitative de réaction en chaîne polymérase en temps réel (qPCR) est une méthode rapide et sensible pour enquêter sur les niveaux d'expression de microARN (miARN différents) des molécules dans des échantillons tumoraux. En utilisant cette expression méthode de centaines de molécules différentes miARN peuvent être amplifiés, quantifiés, analysés et partir du même modèle d'ADNc.
Abstract
Les microARN (miARN) sont simple brin, 18-24 nucléotides de long, non codantes des molécules d'ARN. Ils sont impliqués dans pratiquement tous les processus cellulaires, y compris le développement 1, l'apoptose 2, et la régulation du cycle cellulaire 3. MiARN sont estimés à réguler l'expression de 30% à 90% des gènes humains 4 en se liant à leurs ARN messagers (ARNm cibles) 5. Dérèglement généralisé des miARN a été rapporté dans diverses maladies et sous-types de cancer 6. En raison de leur prévalence et de la structure unique, ces petites molécules sont susceptibles d'être la prochaine génération de biomarqueurs, des agents thérapeutiques et / ou des cibles.
Les méthodes utilisées pour enquêter sur l'expression du miARN comprennent colorant SYBR Green I-base ainsi que Taqman-sonde qPCR base. Si miARN sont pour être utilisés efficacement dans le contexte clinique, il est impératif que leur détection dans de nouvelles et / ou archivés des échantillons cliniques être fiables, reproductibles, et spS PROPRES. qPCR a été largement utilisé pour valider l'expression des miARN dans les analyses du génome entier, comme les études microarray 7. Les échantillons utilisés dans ce protocole étaient des patients ayant subi une prostatectomie radicale pour cancer de la prostate cliniquement localisé, mais d'autres tissus et des lignées cellulaires peuvent être substitués po spécimens de la prostate étaient composant logiciel enfichable congelés dans l'azote liquide après résection. Les variables cliniques et de suivi d'information pour chaque patient ont été recueillies pour une analyse ultérieure 8.
Quantification des niveaux miRNA dans des échantillons de tumeurs de la prostate. Les principales étapes de l'analyse qPCR des tumeurs sont: Total extraction de l'ARN, la synthèse d'ADNc, et la détection des produits qPCR utilisant des amorces spécifiques de miARN. L'ARN total, qui comprend l'ARNm, miRNA, et d'autres petits ARN ont été extraits à partir d'échantillons à l'aide du réactif Trizol. Système de Qiagen miScript a été utilisé pour synthétiser l'ADNc et d'effectuer qPCR (figure 1). MiARN endogènes ne sont pas polyadenylated, donc pendant le processus de transcription inverse, un poly (A) polymérase polyadenylates miRNA. Le miARN est utilisé comme modèle pour synthétiser l'ADNc en utilisant l'oligo-dT et la transcriptase inverse. Séquence d'étiquette universel sur l'extrémité 5 'de l'oligo-dT amorces facilite l'amplification de l'ADNc dans l'étape de PCR. D'amplification du produit de PCR est détectée par le niveau de fluorescence émise par SYBR Green, un colorant qui s'intercale dans l'ADN double brin. Amorces spécifiques miRNA, ainsi que d'une amorce universelle qui se lie à la séquence de balises universel amplifier des séquences spécifiques miRNA.
Les dosages d'amorces miScript sont disponibles pour plus d'un millier spécifiques à l'homme miARN et des centaines de souris spécifiques miARN. Méthode de quantification relative a été utilisée ici pour quantifier l'expression des miARN. À corriger des variations entre les différents échantillons, les niveaux d'expression d'un miARN cible est normalisée à des niveaux d'expression d'un gène de référence. Le choix d'un gesur lequel ne pour normaliser l'expression de cibles est critique dans Procédé quantification relative de l'analyse. Des exemples de gènes de référence généralement utilisés dans cette capacité sont les RNU6B petits ARN, RNU44, et RNU48 car ils sont considérés être exprimé de façon stable dans la plupart des échantillons. Dans ce protocole, RNU6B est utilisé en tant que gène de référence.
Protocol
Discussion
Expressions aberrantes de certains miARN ont été constamment trouvé dans des tumeurs de la prostate par rapport au tissu normal 10, et quelques-uns de ces miARN ont été nommés comme nouveaux agents thérapeutiques potentiels contre le cancer de la prostate 11. Par conséquent, les niveaux d'expression aberrants de miARN peuvent être utiles biomarqueurs diagnostiques et / ou pronostique. La méthodologie qPCR en temps réel vous est présenté ici un essai pour la quantification précise …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le Société canadienne du cancer Institut de recherche, accorder aucune. 019038.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | |
| Light Cycler Capillaries | Roche | 04929292001 |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | 2538 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790 (2003).
- Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).
- Friedman, R. C. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-281 (2004).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).
- Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).
- Gordanpour, A. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer. Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).
- Nam, R. K. Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer. Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).
- Ambs, S. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68, 6162 (2008).
- Liu, C. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat. Med. 17, 211 (2011).
