Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama
Summary
Kantitatif Real Time PCR (qPCR) tümör örneklerinde çeşitli mikroRNA ifade seviyeleri (miRNA) molekülleri araştırmak için hızlı ve duyarlı bir yöntemdir. Farklı miRNA moleküller yüzlerce bu yöntem ifadesi kullanılarak, amplifiye miktarı, ve aynı cDNA şablon ile analiz edilebilir.
Abstract
MicroRNA (miRNA'lar) tek iplikçikli, 18-24 nükleotid uzunluğunda, kodlamayan RNA molekülleri vardır. Onlar geliştirme 1, 2 apoptoz ve hücre döngüsü regülasyon 3 olmak üzere hemen her türlü hücresel işlemi katılmaktadırlar. MiRNA'lar hedef haberci RNA (mRNA) 5 bağlanarak 4 insan genlerinin% 90% 30 ifadesi düzenleyen tahmin edilmektedir. MiRNA'lar yaygın düzensizliği çeşitli hastalıklar ve kanser alt 6 rapor edilmiştir. Yaygınlığı ve benzersiz yapısı sayesinde, bu küçük moleküllerin biyolojik, tedavi ajanları ve / veya hedeflerin nesil olması muhtemeldir.
MiRNA ifade araştırmak için kullanılan yöntemler SYBR yeşil Ben boya dayalı olarak Taqman-prob tabanlı qPCR içerir. MiRNA'lar etkili bir klinik uygulamada kullanılacak olursa, taze ve / veya muhafaza klinik örneklerde bunların algılama, tekrar üretilebilir ve sp olması şarttırecific. qPCR yaygın tür mikroarray çalışmaları 7 gibi tüm genom analizlerinde miRNA'lar ifade doğrulamak için kullanılmıştır. Bu protokolde kullanılan örnekleri klinik lokalize prostat kanseri için radikal prostatektomi yapılan hastaların oldukları gözlenirken, diğer doku ve hücre hatları ek dondurulmuş rezeksiyon sonrası sıvı azot vardı Prostat numuneler in ikame edilebilir. Klinik değişkenler ve her hasta için izlem bilgileri 8 sonraki analiz için toplandı.
Prostat tümörü örneklerinde miRNA düzeylerinin belirlenmesi. Tümörlerin qPCR analizinde temel adımları şunlardır: miRNA-spesifik primerler kullanılarak total RNA ekstraksiyonu, cDNA sentezi ve qPCR ürünlerinin tespiti. MRNA, miRNA ve diğer küçük RNA içerir RNA, TRIzol reaktif kullanılarak örneklerden çıkarıldı. Qiagen Kullanıcı miScript Sistemi cDNA sentez ve qPCR (Şekil 1) gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Endojen miRNA'lar po değildirTers transkripsiyon işlemi sırasında bu nedenle, lyadenylated, bir poli (A) polimeraz miRNA polyadenylates. MiRNA oligo-dT ve Reverse Transcriptase kullanılarak cDNA sentezi için bir şablon olarak kullanılmıştır. Oligo-dT primerlerin 5 'ucunda bir evrensel bir etiket dizisi PCR adımda cDNA'sının çoğaltılmasında kolaylaştırır. PCR ürünü amplifikasyon SYBR Green, çift sarmallı DNA'ya intercalates bir boya tarafından yayılan floresan düzeyi tespit edilir. Evrensel etiketi dizisi bağlanan bir Universal Astar ile birlikte Özgül miRNA astar, özel miRNA dizileri yükseltmek olacaktır.
MiScript Primer Tahliller binin üzerinde insana özgü miRNA'lar ve fare özgü miRNA'lar yüzlerce mevcuttur. Nispi miktar yöntemi miRNA'lar ifadesi ölçmek için kullanılmıştır. Farklı örnekleri arasında değişkenlik düzeltmek için, bir hedef miRNA ifade seviyelerini bir referans genin ekspresyon düzeyleri normalize edilir. Bir GE seçimine analiz Göreceli ölçüm yöntemi kritik hedeflerinin ifade normalleştirmek için olduğu açıktır. Genellikle bu kapasite kullanılan referans gen örnekleri bunlar stabil en örnekleri üzerinden ifade edilmesi olarak kabul edildiğinden, küçük RNA RNU6B, RNU44 ve RNU48 vardır. Bu protokolde, RNU6B referans gen olarak kullanılır.
Protocol
Discussion
Bazı miRNA'lar anormal ifadeler, sürekli normal doku 10, ve bu miRNA'lar bazı prostat kanserine karşı 11 potansiyel yeni terapötik maddeler olarak adlandırılmış olan ile karşılaştırıldığında prostat tümörleri bulunmuştur. Dolayısıyla miRNA anormal ekspresyon düzeyleri yararlı tanısal ve / veya prognostik biyolojik olabilir. Burada sunulan Real-Time qPCR metodolojisi prostat tümör dokusunda miRNA düzeylerinin tayini için daha kesin bir ölçüm sağlar. Kullanı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Kanada Kanser Topluluğu Araştırma Enstitüsü tarafından finanse edildi, hiçbir vermek. 019.038.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | |
| Light Cycler Capillaries | Roche | 04929292001 |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | 2538 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790 (2003).
- Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).
- Friedman, R. C. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-281 (2004).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).
- Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).
- Gordanpour, A. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer. Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).
- Nam, R. K. Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer. Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).
- Ambs, S. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68, 6162 (2008).
- Liu, C. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat. Med. 17, 211 (2011).
