Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om cellen stijfheid te meten. Het algemene principe van deze benadering is membraan vervorming te meten in reactie op welbepaalde negatieve druk aangebracht door een micropipet op het celoppervlak. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om biomechanische eigenschappen van substraat-aangehechte cellen te bestuderen.
Groeiend aantal studies tonen aan dat biomechanische eigenschappen van individuele cellen belangrijke rol spelen in meerdere cellulaire functies, met inbegrip van celproliferatie, differentiatie, migratie en cel-cel interacties. De twee belangrijkste parameters van cellulaire biomechanica cellulair vervormbaarheid of stijfheid en het vermogen van de cellen samentrekken en genereren kracht. Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om cellen stijfheid schatten door de mate van vervorming membraan in reactie op negatieve druk van een glazen micropipet aan het celoppervlak, een techniek die genoemd Micropipet Verlangen of Microaspiration.
Microaspiration wordt uitgevoerd door aan een glazen capillair met een micropipet maken met een zeer kleine tip (2-50 urn diameter afhankelijk van de grootte van een cel of een weefselmonster), die vervolgens wordt verbonden met een pneumatische drukopnemer en afgedaan nabijheid van een cel onder een microscoop. Wanneer depunt van de pipet raakt een cel, een stap van negatieve druk wordt uitgeoefend op de pipet door de pneumatische drukopnemer genereren welbepaalde druk op de celmembraan. Onder druk wordt het membraan opgezogen in de pipet en progressieve vervorming membraan of "membraan projection" in de pipet wordt gemeten als functie van de tijd. Het basisprincipe van deze experimentele benadering is dat de mate van vervorming membraan in reactie op een bepaalde mechanische kracht is een functie van membraan stijfheid. Hoe stijver het membraan, hoe langzamer de snelheid van membraanassociatie vervorming en hoe korter de steady-state aspiratie length.The techniek uitgevoerd op geïsoleerde cellen, zowel in suspensie en substraat vastgemaakte grote organellen worden, en liposomen.
Analyse vindt plaats door vergelijking maximale membraan vervormingen bereikt onder een bepaalde druk voor verschillende celpopulaties of experimentele omstandigheden. Een "stijfheid coëfficiënt" is estimated getrokken waarbij de aangezogen lengte van vervorming membraan als functie van de toegepaste druk. Bovendien kunnen de gegevens verder worden geanalyseerd om de Young's modulus van de cellen (E), de meest voorkomende parameter stijfheid van materialen kenmerken schatten. Het is belangrijk op te merken dat plasma membranen van eukaryote cellen kunnen worden beschouwd als een bi-component systeem waar membraan lipide dubbellaag wordt underlied de sub-membraan cytoskelet en dat het het cytoskelet dat de mechanische steiger van het membraan vormt en domineert de vervormbaarheid van de cellulaire envelop. Deze benadering derhalve kan het sonderen van de biomechanische eigenschappen van het sub-membraan cytoskelet.
Microaspiration een eenvoudige en zeer reproduceerbare methode cel stijfheid / vervormbaarheid schatten door negatieve druk op een celmembraan en het meten membraan vervormbaarheid in reactie op welbepaalde druk. Het werd voor het eerst ontwikkeld door Mitchison en Swann (1954) om de elastische eigenschappen van de zee-egel eitjes te karakteriseren om inzicht te verschaffen in de mechanismen van celdeling 21 en vervolgens te kijken naar de mechanische eigenschappen in de rode bloedcellen 1. Deze me…
The authors have nothing to disclose.
Name of reagent | Company | Catalog/Model Number | Comments |
Sutter pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
Microforge | Narishige | MF-830 | |
Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | Axiovert 200M | The microscope should be preferably equipped with 3D/deconvolution capabilities. |
Videocamera | Zeiss | AxioCam MRm | |
Image Acquisition sotware | Zeiss | AxioVision | |
Pneumatic Pressure Transducer | BioTek | DPM-1B | DPM1B Pneumatic Transducer Tester can now be found by FLUKE. |
Pipette glass | Richland | Customized glass | Pipettes were customized with a 1.2 inner diameter and 1.6 outer diameter. |
DiI Dye | Invitrogen | D282 | Dissolves well in DMSO |