Aspirazione Micropipetta di celle substrato-attached per Stima rigidità cellulare
Summary
Qui si descrive un metodo rapido e semplice per misurare la rigidità delle cellule. Il principio generale di questo approccio è di misurare la deformazione della membrana in risposta a ben definito pressione negativa applicata mediante una micropipetta alla superficie cellulare. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare le proprietà biomeccaniche del substrato-attached cellule.
Abstract
Crescente numero di studi dimostrano che le proprietà biomeccaniche delle singole cellule svolgono un ruolo importante in molteplici funzioni cellulari, tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione, la migrazione e interazioni cellula-cellula. I due parametri chiave di biomeccanica cellulari sono deformabilità cellulare o rigidità e la capacità delle cellule di contrarsi e generare forza. Qui si descrive un metodo rapido e semplice per valutare la rigidità cellulare misurando il grado di deformazione della membrana in risposta alla pressione negativa applicata da una micropipetta di vetro alla superficie cellulare, una tecnica che si chiama Aspirazione Micropipetta o microaspirazione.
Microaspirazione viene eseguita tirando un capillare di vetro per creare una micropipetta con una punta molto piccola (2-50 micron di diametro a seconda delle dimensioni di una cellula o di un campione di tessuto), che viene poi collegato ad un trasduttore di pressione pneumatica e portato a termine prossimità di una cellula al microscopio. Quando l'punta della pipetta tocca una cella, una fase di pressione negativa è applicata alla pipetta dal trasduttore di pressione pneumatica di generazione di pressione ben definito sulla membrana cellulare. In risposta alla pressione, la membrana viene aspirata nella deformazione della membrana pipetta e progressivo o "proiezione membrana" nella pipetta viene misurato in funzione del tempo. Il principio di base di questo approccio sperimentale è che il grado di deformazione della membrana in risposta ad una forza meccanica definita è una funzione della rigidezza della membrana. La membrana è più rigido, più lenta è la velocità di deformazione della membrana e più breve è il regime tecnica length.The aspirazione può essere eseguita su cellule isolate, sia in sospensione e substrato-annessi, organelli grandi, e liposomi.
Analisi viene eseguita confrontando deformazioni della membrana massimi raggiunti sotto una data pressione di diverse popolazioni cellulari o condizioni sperimentali. Un "coefficiente di rigidezza" è estimated tracciando la lunghezza aspirato di deformazione della membrana in funzione della pressione applicata. Inoltre, i dati possono essere ulteriormente analizzati per stimare il modulo di Young delle cellule (E), il parametro più comune per caratterizzare rigidità dei materiali. È importante notare che la membrana plasmatica delle cellule eucariotiche possono essere visti come una bi-componente in cui è underlied bistrato lipidico di membrana dalla sub-membrana citoscheletro e che è il citoscheletro che costituisce l'impalcatura meccanica della membrana e domina la deformabilità della busta cellulare. Questo approccio, pertanto, permette di sondare le proprietà biomeccaniche del sub-membrana citoscheletro.
Protocol
Discussion
Microaspirazione fornisce un metodo semplice e altamente riproducibili stimare rigidità cellule / deformabilità applicando pressione negativa ad una membrana cellulare e misurare la deformabilità della membrana in risposta alla pressione ben definita. È stato inizialmente sviluppato da Mitchison e Swann (1954) per caratterizzare le proprietà elastiche dei ricci di mare uova di fornire uno sguardo sui meccanismi di divisione cellulare 21 e poi a guardare le proprietà meccaniche dei globuli rossi 1.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog/Model Number | Comments |
| Sutter pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | Axiovert 200M | The microscope should be preferably equipped with 3D/deconvolution capabilities. |
| Videocamera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Image Acquisition sotware | Zeiss | AxioVision | |
| Pneumatic Pressure Transducer | BioTek | DPM-1B | DPM1B Pneumatic Transducer Tester can now be found by FLUKE. |
| Pipette glass | Richland | Customized glass | Pipettes were customized with a 1.2 inner diameter and 1.6 outer diameter. |
| DiI Dye | Invitrogen | D282 | Dissolves well in DMSO |
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