שאיפת micropipette של תאי מצע מצורפים להערכת נוקשות סלולריות
Summary
כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה למדידת נוקשות תא. העיקרון הכללי של גישה זו הוא למדוד עיוות קרום בתגובה ללחץ שלילי מוגדר היטב ליישם באמצעות micropipette על פני התא. שיטה זו מספקת כלי רב עצמה כדי לחקור את התכונות של תאי מצע biomechanical-מצורפים.
Abstract
מספר גדל והולך של מחקרים מראה כי מאפיינים ביומכניים של תאים בודדים לשחק תפקידים מרכזיים בתפקודים תאיים רבים, כולל תרבות של תאים, התמיינות, הגירה ואינטראקציות תא סלולרי. שני הפרמטרים המרכזיים של ביומכניקה הסלולרית הם deformability סלולרי או קשיחות והיכולת של התאים להתכווץ ולייצר כוח. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה להערכת נוקשות תא על ידי מדידת מידת עיוות קרום בתגובה ללחץ שלילי מיושם על ידי micropipette זכוכית לתא השטח, טכניקה שנקראת איפת micropipette או Microaspiration.
Microaspiration מתבצע על ידי משייכת זכוכית נימים ליצור micropipette עם טיפ קטן מאוד (2-50 קוטר מיקרומטר תלוי בגודל של תא או דגימת רקמה), אשר לאחר מכן הוא מחובר למתמר לחץ פנאומטי והביא לסיומו קרבת תא מתחת למיקרוסקופ. כאשרקצה פיפטה נוגע תא, שלב של לחץ שלילי יוחל על פיפטה ידי מתמר לחץ פנאומטי יצירת לחץ מוגדר היטב על קרום התא. בתגובה ללחץ, הממברנה להישאף לעיוות קרום פיפטה ומתקדמת או "היטל קרום" לתוך פיפטה נמדדת כפונקציה של זמן. העיקרון הבסיסי של גישה ניסויית זה הוא שמידת עיוות קרום בתגובה לכוח מכאני מוגדר היא פונקציה של קשיחות הממברנה. הקרום הוא נוקשה, השיעור האיטי יותר של עיוות קרום וטכניקת length.The שאיפת המצב יציב ניתן לבצע קצר בתאים מבודדים, היא בהשעיה ומצע-מצורפי האברונים, גדולים, וליפוזומים.
ניתוח מתבצע על ידי השוואת דפורמציות קרום מקסימליים שהושגו תחת לחץ נתון לאוכלוסיות תאים שונים או בתנאי ניסוי. "מקדם קשיחות" הוא estimated ידי התוויית האורך נשאף, של עיוות הממברנה כפונקציה של לחץ המופעל. יתר על כן, את הנתונים ניתן לנתח נוסף להעריך מודולוס של יאנג של התאים (ה '), הפרמטר הנפוץ ביותר לאפיון קשיחות של חומרים. חשוב לציין כי קרום פלזמה של תאים האיקריוטים יכול להיחשב כמערכת דו מרכיב בי bilayer שומני הממברנה underlied ידי cytoskeleton-קרום משנה ושזה cytoskeleton המהווה הפיגום המכאני של הקרום ושולט deformability של מעטפת התאים. גישה זו, אם כן, מאפשרת לחקור את התכונות של biomechanical cytoskeleton משנה הממברנה.
Protocol
Discussion
Microaspiration מספק שיטה פשוטה ולשעתק מאוד להעריך נוקשות תא / deformability על ידי הפעלת לחץ שלילי על קרום תא ומדידת deformability קרום בתגובה ללחץ מוגדר היטב. היא פותחה לראשונה על ידי Mitchison וסוואן (1954) כדי לאפיין את תכונות האלסטיות של ביצי קיפודי ים כדי לספק תובנה לתוך מנגנוני חלוקת תא <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog/Model Number | Comments |
| Sutter pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | Axiovert 200M | The microscope should be preferably equipped with 3D/deconvolution capabilities. |
| Videocamera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Image Acquisition sotware | Zeiss | AxioVision | |
| Pneumatic Pressure Transducer | BioTek | DPM-1B | DPM1B Pneumatic Transducer Tester can now be found by FLUKE. |
| Pipette glass | Richland | Customized glass | Pipettes were customized with a 1.2 inner diameter and 1.6 outer diameter. |
| DiI Dye | Invitrogen | D282 | Dissolves well in DMSO |
References
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. I. Membrane stiffness and intracellular pressure. Biophys. J. 4, 115-135 (1964).
- Discher, D. E., Mohandas, N., Evans, E. A. Molecular maps of red cell deformation: hidden elasticity and in situ connectivity. Science. 266, 1032-1035 (1994).
- Schmid-Schönbein, G. W., Sung, K. L., Tözeren, H., Skalak, R., Chien, S. Passive mechanical properties of human leukocytes. Biophys. J. 36, 243-256 (1981).
- Guilak, F., Tedrow, J. R., Burgkart, R. Viscoelastic properties of the cell nucleus. Biochem. Biophys. Re.s Commun. 269, 781-786 (2000).
- Needham, D., Nunn, R. S. Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol. Biophys. J. 58, 997-1009 (1990).
- Sato, M., Theret, D. P., Wheeler, L. T., Ohshima, N., Nerem, R. M. Application of the micropipette technique to the measurement of cultured porcine aortic endothelial cell viscoelastic properties. Journal of Biomechanical Engineering. 112, 263-268 (1990).
- Theret, D. P., Levesque, M. J., Sato, F., Nerem, R. M., Wheeler, L. T. The application of a homogeneous half-space model in the analysis of endothelial cell micropipette measurements. J. of Biomechanical Engineering. 110, 190-199 (1988).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. J. Biomech. 33, 15-22 (2000).
- Lim, C. T., Zhou, E. H., Quek, S. T. Mechanical models for living cells–a review. Journal of Biomechanics. 39, 195 (2006).
- Zhao, R., Wyss, K., Simmons, C. A. Comparison of analytical and inverse finite element approaches to estimate cell viscoelastic properties by micropipette aspiration. Journal of Biomechanics. 42, 2768 (2009).
- Chien, S., Sung, K. L., Skalak, R., Usami, S., Tozeren, A. Theoretical and experimental studies on viscoelastic properties of erythrocyte membrane. Biophys. J. 24, 463-487 (1978).
- Evans, E., Kuhan, B. Passive material behavior of granulocytes based on large deformation and recovery after deformation tests. Blood. 64, 1028-1035 (1984).
- Sato, M., Levesque, M. J., Nerem, R. M. Micropipette aspiration of cultured bovine aortic endothelial cells exposed to shear stress. Arteriosclerosis. 7, 276-286 (1987).
- Byfield, F., Aranda-Aspinoza, H., Romanenko, V. G., Rothblat, G. H., Levitan, I. Cholesterol depletion increases membrane stiffness of aortic endothelial cells. Biophys. J. 87, 3336-3343 (2004).
- Byfield, F. J., Hoffman, B. D., Romanenko, V. G., Fang, Y., Crocker, J. C., Levitan, I. Evidence for the role of cell stiffness in modulation of volume-regulated anion channels. Acta. Physiologica. 187, 285-294 (2006).
- Byfield, F. J., Reen, R. K., Shentu, T. -. P., Levitan, I., Gooch, K. J. Endothelial actin and cell stiffness is modulated by substrate stiffness in 2D and 3D. Journal of Biomechanics. 42, 1114 (2009).
- Evans, E., Needham, D. Physical properties of surfactant bilayer membranes: thermal transitions, elasticity, rigidity, cohesion and colloidal interactions. Journal of Physical Chemistry. 91, 4219-4228 (1987).
- Sun, M., Northup, N., Marga, F., Huber, T., Byfield, F. J., Levitan, I., Forgacs, G. The effect of cellular cholesterol on membrane-cytoskeleton adhesion. J. Cell. Sci. 120, 2223-2231 (2007).
- Shentu, T. P., Titushkin, I., Singh, D. K., Gooch, K. J., Subbaiah, P. V., Cho, M., Levitan, I. oxLDL-induced decrease in lipid order of membrane domains is inversely correlated with endothelial stiffness and network formation. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, 218-229 (2010).
- Norman, L. L., Oetama, R. J., Dembo, M., Byfield, F., Hammer, D. A., Levitan, I., Aranda-Espinoza, H. Modification of Cellular Cholesterol Content Affects Traction Force, Adhesion and Cell Spreading. Cell Mol. Bioeng. 3, 151-162 (2010).
- Mitchinson, J. M., Swann, M. M. The Mechanical Properties of the Cell Surface: I. The Cell Elastimeter. J. of Experimental Biology. 31, 443-460 (1954).
- Byfield, F. J., Tikku, S., Rothblat, G. H., Gooch, K. J., Levitan, I. OxLDL increases endothelial stiffness, force generation, and network formation. J. Lipid Res. 47, 715-723 (2006).
- Ohashi, T., Ishii, Y., Ishikawa, Y., Matsumoto, T., Sato, M. Experimental and numerical analyses of local mechanical properties measured by atomic force microscopy for sheared endothelial cells. Biomed. Mater. Eng. 12, 319-327 (2002).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophysical Journal. 93, 4453 (2007).
- Kowalsky, G. B., Byfield, F. J., Levitan, I. oxLDL facilitates flow-induced realignment of aortic endothelial cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 295, 332-340 (2008).
- Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. , (2011).
- Kole, T. P., Tseng, Y., Huang, L., Katz, J. L., Wirtz, D. Rho kinase regulates the intracellular micromechanical response of adherent cells to rho activation. Mol. Biol. Cell. 15, 3475-3484 (2004).
- Hall, A. Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton. Science. 279, 509-514 (1998).
- Okajima, T. Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In. Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Fabry, B., Maksym, G. N., Butler, J. P., Glogauer, M., Navajas, D., Fredberg, J. J. Scaling the microrheology of living cells. Physical Review Letters. 87, 148102 (2001).
- Park, C. Y., Tambe, D., Alencar, A. M., Trepat, X., Zhou, E. H., Millet, E., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Mapping the cytoskeletal prestress. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Shin, D., Athanasiou, K. Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties. J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).
- Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers. Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).
- Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers. Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).
