In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico
Summary
Il saggio di liquidazione mesoteliali qui descritto si avvale di cellule fluorescente e microscopia time-lapse video visualizzare e misurare quantitativamente le interazioni di sferoidi multicellulari di cancro ovarico e monostrati di cellule mesoteliali. Questo saggio modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico.
Abstract
Il cancro ovarico è la quinta causa di decessi per cancro correlati negli Stati Uniti 1. Nonostante un iniziale risposta positiva alle terapie, da 70 a 90 per cento delle donne con tumore ovarico sviluppare nuove metastasi, e la ricorrenza è spesso fatale 2. Si tratta, quindi, necessario capire come metastasi secondarie sorgono al fine di sviluppare migliori trattamenti per il cancro fase intermedia e tardiva dell'ovaio. Metastasi del cancro ovarico si verifica quando le cellule maligne si staccano dal tumore primario e diffondere in tutta la cavità peritoneale. Le cellule diffusi possono formare aggregati multicellulari, o sferoidi, che uno rimanga unattached, o impianto sul organi all'interno della cavità peritoneale 3 (figura 1, film 1).
Tutti gli organi all'interno della cavità peritoneale sono rivestite con un unico strato continuo di cellule mesoteliali 4-6 (Figura 2). Tuttavia, le cellule mesoteliali sono assenti da sottomasse tumorali peritoneali, come rivelato dagli studi al microscopio elettronico di sezioni umani asportati 3,5-7 tessuto tumorale (Figura 2). Questo suggerisce che le cellule mesoteliali sono esclusi da sotto la massa tumorale da un processo sconosciuto.
Precedente esperimenti in vitro hanno dimostrato che cellule primarie di cancro ovarico collegare in modo più efficace matrice extracellulare che di cellule mesoteliali 8, e studi più recenti hanno dimostrato che le cellule primarie peritoneali mesoteliali in realtà costituiscono una barriera per l'adesione delle cellule del cancro ovarico e l'invasione (rispetto alla adesione e l'invasione su supporti che non sono stati coperti con le cellule mesoteliali) 9,10. Questo suggerisce che le cellule mesoteliali fungere da barriera contro il cancro ovarico metastasi. I meccanismi cellulari e molecolari con cui le cellule del cancro ovarico violare questa barriera, ed escludere il mesotelio hanno, fino a poco tempo, è rimasto sconosciuto.
Qui si descrive °metodologia e di un test in vitro che modella l'interazione tra sferoidi di cellule di cancro ovarico e cellule mesoteliali in vivo (figura 3, Movie 2). Il nostro protocollo è stato adattato da metodi descritti in precedenza per analizzare le interazioni delle cellule tumorali ovariche con monostrati mesoteliali 8-16, ed è stata descritta in un rapporto che mostra che le cellule tumorali ovariche utilizzano un integrina-dipendente l'attivazione della miosina e la forza di trazione per promuovere l'esclusione del cellule mesoteliali da sotto un tumore 17 sferoide. Questo modello si avvale di time-lapse microscopia a fluorescenza per monitorare le due popolazioni cellulari in tempo reale, fornendo informazioni spaziale e temporale sull'interazione. Le cellule del carcinoma ovarico esprimere la proteina fluorescente rossa (RFP), mentre le cellule mesoteliali esprimere la proteina fluorescente verde (GFP). RFP che esprimono sferoidi di cellule di cancro ovarico allegare alla GFP-esprimere monostrato mesoteliali. La diffusione sferoidi, invadere, eforzare le cellule mesoteliali parte creando un foro nel monostrato. Questo foro è visualizzato come lo spazio negativo (nero) nell'immagine GFP. L'area del foro può essere misurata per analizzare quantitativamente differenze di attività di gioco tra le popolazioni di controllo e sperimentali di cancro ovarico e / o cellule mesoteliali. Questo saggio necessita soltanto un piccolo numero di cellule di cancro ovarico (100 cellule per sferoidali X 20-30 sferoidi per condizione), quindi è possibile eseguire questo saggio con preziosi campioni di cellule del tumore primario. Inoltre, questa analisi può essere facilmente adattato per lo screening ad alto rendimento.
Protocol
Discussion
Il "test Liquidazione mesoteliale" qui presentata usa microscopia time-lapse per monitorare le interazioni di sferoidi multicellulari di cancro ovarico e monostrati di cellule mesoteliali, in grande dettaglio spaziale e temporale. In precedenza, diversi gruppi 8-14 aveva usato saggi endpoint per dimostrare che le cellule tumorali ovariche attaccarsi e invadere monostrati di cellule mesoteliali. Questo saggio è unico in quanto utilizza celle fluorescente di distinguere le cellule tumorali da cellule…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare la Nikon Imaging Center presso la Harvard Medical School, in particolare Jennifer Waters, Lara Petrak e salmone Wendy, per la formazione e l'uso delle loro microscopi timelapse. Vorremmo anche ringraziare Rosa Ng e Achim Besser per le discussioni importanti. Questo lavoro è stato supportato dal NIH di Grant 5695837 (da M. Iwanicki) e GM064346 di ACC, da una sovvenzione dal Dott. Miriam e Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (a JSB).
Materials
| Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| OVCA433 Ovarian Cancer Cells | Gift from Dr. Dennis Slamon | ||
| ZT Mesothelial Cells | Gift from Dr. Tan Ince | ||
| Medium 199 | Gibco | 19950 | |
| MCDB105 | Cell Applications Inc. | 117-500 | |
| FBS-heat inactivated | Gibco | 10082 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15070 | |
| 96 well plates | Corning Costar | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | 192066-25G | For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Dilute to 95% in dH20 |
| Cell culture hood | Nuaire | NU-425-300 | |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| incubator for poly-HEMA plates | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus | 75003429/01 | |
| 6 well glass-bottom dish | MatTek corp. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-1MG | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Timelapse Microscope: | |||
| Microscope | Nikon | Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System | |
| Lens | Nikon | 20X-0.75 numerical apeture | |
| Halogen transilluminator | Nikon | 0.52 NA long working distance condenser | |
| Excitation and emission filters | Chroma single pass filters in Nikon housing | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Transmitted and Epifluoresce light path | Sutter | Smart Shutters | |
| Linear-encoded motorized stage | Nikon | ||
| Cooled charged-coupled device camera | Hamamatsu | ORCA-AG | |
| Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control | custom-built | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| NIS-Elements software | Nikon | Version 3 |
Riferimenti
- Jemal, A. . CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. . SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , (2007).
- Burleson, K. M. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall. Cancer Res. 25, 490-497 (1965).
- Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion. Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).
- Zhang, X. Y. Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources. J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion. Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Ksiazek, K. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).
- Heyman, L. Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).
- Heyman, L. Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells. Cell. Biol. Int. 34, 493-502 .
- Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity. Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).
- Leroy-Dudal, J. Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2. Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).
- Iwanicki, M. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).
- Roberts, P. C. Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model. Neoplasia. 7, 944-956 (2005).
- Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).
- Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).
- Brandt, B. 3D-extravasation model — selection of highly motile and metastatic cancer cells. Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).
- Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension. Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).
- Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells. J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).
- Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation. Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).
